1、第一章 复习,1、1928年弗莱明发现的产青霉素的菌种是（）。 2、Florey从烂西瓜中分离出来的产青霉素的菌种是（）。 3、青霉素是含有（）结构的抗生素，青霉素的母核是（）。 4、人乙型肝炎免疫球蛋白适用于（）、（）和（）。,1、点青霉 2、产黄青霉 3、-内酰胺环，6-APA。 4、乙型肝炎表面抗原（HbsAg）阳性的母亲及所生的婴儿。 2.意外感染的人群。 3.与乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒携带者密切接触者。,OKT3为抗人类外周淋巴细胞单克隆抗体； OKT3为高纯度的淋巴细胞抗体。其抗原取自人类淋巴细胞的3抗原，与小鼠脾脏产生抗体的细胞在体外与小鼠骨髓瘤细胞相融合，由筛选出的杂交瘤细胞
2、所分泌的单克隆抗体。,在体内OKT3可与大部分外周血T细胞和机体组织中T细胞发生反应，而不与其他血液成分或组织发生反应。 OKT3通过作用于T细胞表面的T3（CD3+）抗原识别结构，不仅能清除CD3+细胞，阻断T细胞识别抗原的功能，还能阻断已产生的杀伤性T细胞的功能和细胞介导的细胞毒性，是目前公认的一种能较好逆转移植肾急性排斥反应(AR)的免疫抑制剂 。,泰欣生的抗肿瘤作用机理： EGFR在多种实体瘤中过度表达，如头颈癌、肺癌、结直肠癌中，都存在EGFR过度表达现象。EGFR的过度表达与肿瘤的高侵袭力、高转移性及不良预后高度相关。泰欣生能够竞争性结合EGFR，阻断由EGFR与其介导的下游信号转
3、导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、增强放化疗疗效。 泰欣生，是全球第一个以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的单抗药物，中国第一个治疗恶性肿瘤的人源化单克隆抗体。,重组人血管内皮抑制素注射液：拥有多项自主知识产权，被科技日报评为2005年度中国十大科技新闻之一的项目-世界首创重组血管内皮抑素注射液（商品名:恩度,Endostar）的研制，近日在烟台麦得津生物工程股份有限公司通过国家GMP生产验证。 这标志着中国在抗血管生成类肿瘤药物的创新和产业化方面已经走在了世界最前沿。 40年前，美国哈佛大学医学院Judah Folkman教授提出了著名的“饿死肿瘤疗法
4、”理论，即通过阻断肿瘤新生血管生成切断肿瘤营养供给，达到抑制和治疗肿瘤的目的。,CEP：欧洲药典适应性认证证书（Certificate of European Pharmacopoeia）,第二章 复习,1、在制药工业中为什么要制备无热原质水？ 热原质的定义 热原质的理化性质 热原反应 引起热原反应的因素 如何制无热原质水 无热原质水的保存方式,热原质（pyrogen） 热原质即菌体中的脂多糖，大多是革兰氏阴性菌产生的。注入人或动物体内能引起发热反应，故名热原质。理化性质： 耐热性：热原在60加热1h不受影响，100也不会发生热解。但热原的耐热性有一定的限度，如120加热4h能破坏98%，在1
5、80200干热2h以上或250加热30min可彻底破坏。 滤过性：热原体积小，能通过除菌滤器而进入滤液中。,水溶性及不挥发性：热原本身不挥发，但可随水气雾滴夹带入蒸馏水中，故制备注射用水的重蒸馏水器有隔沫装置。 其他：热原能被强酸强碱所破坏，也能被氧化剂如KMnO4或H2O2或超声波所破坏，能被活性炭、石棉或吸附剂所吸附。热原在溶液中带有一定的电荷，因而可被某些离子交换树脂吸附。,热原反应pyrogen reaction,临床上在进行静脉滴注大量输液时，由于药液中含有热原，病人在0.51h内出现冷颤、高热、出汗、昏晕、呕吐等症状，高热时体温可达40，严重者甚至可休克，这种现象称为热原反应。 引
6、起热原反应的主要原因是注射液或输液器中污染的热原所引起的。,发热激活物（pyrogenicactivator）：能激活产内生致热原细胞，使其产生和释放内生致热原的物质。 包括外致热原（exogenouspyrogen)如内毒素（LPS）和某些体内产物 。 另外，LPS中的类脂A为亲脂性基团，能与血管壁细胞膜结合，改变血管通透性，使血压下降导致休克。 热原的致热反应可被水杨酸类解热剂所对抗 。,无热原质水的制备,药液、水等被细菌污染后，即使高压灭菌或经滤过除菌仍可有热原质存在，输注机体后可引起严重发热反应。 生物制品或注射液制成后除去热原质比较困难，所以，必须使用无热原质水制备。,注射用水的制备
7、、贮存和分配应能防止微生物的滋生和污染。贮罐和输送管道所用材料应无毒、耐腐蚀。管道的设计和安装应避免死角、盲管。贮罐和管道要规定清洗、灭菌周期。 注射用水贮罐的通气口应安装不脱落纤维的疏水性除菌滤器。 注射用水的贮存可采用80以上保温、65以上保温循环或4以下存放。,蒸馏蒸馏不同于其它形式的水纯化，因为水从不洁的水中提取出来，水经过了相变，从液态至汽态又回到液态，污渍沸点高于水（100C）将留在锅炉内，,冷凝后，只有水及沸点低的残渣留下来。蒸馏法对原水中不发挥性的有机物、无机物，包括悬浮物、胶体、细菌、病毒、热原等杂质有很好的去除作用。,水生细菌对热比较敏感，一般不会在高于60的条件下繁殖，且
8、循环水对管道内壁保持有较大的冲刷力，高流速的水可以将系统中的微生物或细小的固体颗粒带走，以提高循环系统控制微生物污染的能力。 因此，在贮存方式中，以65以上保温循环较为常用。由于水在系统中循环时，温度会有所改变，为了使系统温度始终保持在65以上，在系统中设置热交换器是很必要的。水在循环时流速应高于2米/秒，即保持湍液循环状态。,中国药典（2000年版）规定“本品（注射用水）为纯化水经蒸馏所得的水”。,发热,发热激活物,外致热原,体内产物,外毒素,内毒素,真菌等,Ag-Ag复合物,类固醇,致炎物,产内生致 热原细胞,内生致热原,激活,产 生 释 放,2、N-乙酰半胱氨酸的作用机理 N-乙酰半胱氨
9、酸为粘液溶解剂，其分子中所含的巯基(-SH)能使痰液中糖蛋白多肽链中的二硫键(-S-S)断裂从而降低痰液粘度，促进痰液排出，用于浓稠痰粘液过多的呼吸系统疾病：急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张症。,3、5-氟尿嘧啶的作用机理,5-氟尿嘧啶如果投与动物，可和尿嘧啶同样地被吸收而阻碍细胞的增殖。作用机理：5-FU在体内必须转化为相应的核苷酸才能发挥其抑制肿瘤的作用。 本药在体内先转变成-氟-脱氧尿嘧啶核苷酸，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，抑制DNA的生物合成，这是其抗肿瘤的主要机理 ；此外，还能渗入RNA，阻止尿嘧啶渗入RNA而抑制RNA的合成。 临床用于结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢
10、癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、头颈部鳞癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌等。,蛋白质水解法：酸水解、碱水解和酶水解。 盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是L-型氨基酸，缺点是Trp全部被破坏，Ser等部分被破坏。 碱水解法易产生消旋作用。 酶水解法不够完全。,触珠蛋白也称结合珠蛋白(haptoglobin;Hp) 结合珠蛋白是一种血浆糖蛋白，能与红细胞外血红蛋白(Hb)结合形成紧密的非共价复合物Hb-Hp。 人体每天降解的Hb约有10%释入血循环中，成为红细胞外游离的Hb，Hb与Hp结合成Hb-Hp复合物后分子量可达155,000，不能透过肾小球，从而防止游离血红蛋白从肾脏丢失，避免H
11、b所含铁的丢失，保证铁再用于合成代谢。,Hp,Hb,MW155,000,溶血性贫血患者血浆结合珠蛋白浓度下降。这是由于溶血时大量的Hb释出，Hp与游离Hb结合成复合物而被肝细胞摄取、清除。,血红素结合蛋白（hemopexin,Hpx）和游离血红素有特异结合能力。它可配合结合珠蛋白对血红蛋白进行处理。 当广泛溶血时，血浆结合珠蛋白耗竭，循环中游离的血红蛋白可降解为珠蛋白和血红素两部分。血红素不溶于水，可与Hpx结合成复合物而运输到肝，分子中的铁可被机体重新利用，卟啉环降解为胆红素而由胆管排出。,Hb,珠蛋白,+,血红素,Hpx,血红素,Hpx,Hpx并不能与血红蛋白结合，仅可与血红素可逆地结合，
12、而在血循环中反复利用，这是机体有效地保存铁的又一种方式，而避免血红蛋白和血红素从肾排出体外。,铁转运蛋白(transferrin;Tf) 铁转运蛋白是由肝脏内合成的糖蛋白，分子量约80,000。具高度多态性，目前已发现20多种不同类型的Tf。每分子Tf可结合2分子的Fe3+。 铁转运蛋白的生理功能是将铁运送到需要铁的组织与细胞。每天血红蛋白分解代谢，释出25mg左右的铁。游离铁有毒性，它与Tf结合后不仅毒性降低而且还将铁运送到需铁部位。,铁是许多含铁蛋白质生物活性的发挥所必不可少的，如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶等。 因此，任何生长、增殖细胞的膜上都有铁转运蛋白的受体。携带Fe3+
13、的Tf与受体结合后经内吞作用进入细胞内，供细胞内合成利用。,铜蓝蛋白(ceruloplasmin;Cp) 也是由肝脏合成的一种糖蛋白。每分子Cp可牢固地结合6个铜离子，并因携铜而呈蓝色。 Cp除作为铜的载体外，还具有氧化酶的活性，可将Fe2+氧化为Fe3+，利于铁掺入铁转运蛋白，促进铁的运输。 正常人体内含铜约100-150mg。血浆中的铜90%由Cp转运，10%与白蛋白结合而运输。成人每日摄取铜2mg，主要在小肠上段吸收，同白蛋白结合送输到肝，即掺入肝细胞合成Cp。部分铜可从胆汁中排出。肝病时铜蓝蛋白合成减少，血浆Cp含量降低。,1-抗胰蛋白酶缺乏症是血中抗蛋白酶成份，1-抗胰蛋白酶（简称1
14、-AT）缺乏引起的一种先天性代谢病，通过常染色体遗传。临床特点为新生儿肝炎，婴幼儿和成人的肝硬化、肝癌和肺气肿等。 正常人体内常存在外源性和内源性蛋白酶，如细菌毒素和白细胞崩解出的蛋白酶对肝脏及其他脏器有破坏作用，1-AT可拮抗这些酶类，以维持组织细胞的完整性。,1-AT缺乏时，这些酶均可侵蚀肝细胞，尤其是新生儿肠腔消化吸收功能不完善，大分子物质进入血液更多，1-AT缺乏的婴儿肝脏更易受损害。 此外，1-AT还具有调节免疫应答、影响抗原-抗体免疫复合物清除、补体激活以及炎症反应的作用，并可抑制血小板的凝聚和纤溶的发生。1-AT缺乏时上述机体平衡的机制失调，导致组织损伤。,抗肿瘤的酶,L-门冬酰
15、胺酶、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、组氨酸酶、酪氨酸氧化酶等。 L-门冬酰胺酶：临床上主要用于白血病的治疗。 L-门冬酰胺酶 门冬酰胺 门冬氨酸+氨 门冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸。正常细胞有自身合成门冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当用本品使门冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞因既不能从血中取得足够门冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白质合成受障碍，增殖受抑制，细胞大量破坏而不能生长、存活。 适用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。,透明质酸（Haluronic ac
16、id、HA）又名玻璃酸，透明质酸是一种酸性粘多糖，美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。 透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水、电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。 尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子（Natural moisturizing factor，NMF）例如：2的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98水分。,透明质酸是一种多功能基质，透明质酸（玻璃酸）HA广泛分布于人体各部位。 其中皮肤也含有大量的透明质酸。人类皮肤成熟和老化过程也
17、随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。,硫酸软骨素,硫酸软骨素是从动物组织中提取制备的酸性粘多糖类物质，分子中带有大量的负电荷，具有调脂、抗炎及弱的抗凝血、抗血栓生物活性，对维持细胞环境的相对稳定性和正常功能具有重要作用。 硫酸软骨素对角膜胶原纤维具有保护作用，能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除；其聚阴离子具有强的保水性，能改善眼角膜组织的水分代谢，对角膜有较强的亲和力，能在角
18、膜表面形成一层透气保水膜，促进角膜创伤的愈合及改善眼部干燥症状。,第三章 复习,干扰素（interferon）。 （干扰素）是最早发现、研究最多、第一个被克隆、第一个用于临床治疗疾病的细胞因子。 干扰素在生物中普遍存在，是一组多功能细胞因子，在正常个体的脾脏、肝脏、肾脏、外周血淋巴细胞和骨髓中都可以检出，又可以被多种因素诱发分泌，如各种病毒、双链RNA、细胞内繁殖的微生物、细菌产物、多聚体等，其中以（病毒）和（双链RNA）的诱导最为有效。,3.1.1.2 干扰素的分类 1）根据对酸和热的耐受性可将天然干扰素分为两种类型：型和型。 型干扰素可以耐受pH2处理或601h的加热，而型干扰素则被这种处
19、理灭活。 2）根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为： IFN- 、IFN-、IFN-、IFN-、IFN-。IFN-由（白细胞）产生，IFN-由（成纤维细胞）产生，但它们的生物学活性相近，作用于相同的细胞受体。 而IFN-主要由（T淋巴细胞）和（NK细胞）产生，属于型干扰素。,在同一型干扰素内按照氨基酸序列和组成的差异又可分为不同的亚型， IFN-有25个亚型、IFN-有4个亚型、IFN-有4个以上亚型。在同一亚型内又因个别氨基酸的差异而细分，如1a、2a 、2b。 中国人在受病毒攻击后白细胞所产生的多种IFN-中，以1b型为主。 rhIFN-1b是我国药品监督管理局批准上
20、市的第一个基因工程药物。,2) IFN- IFN-与IFN-基因的同源性高达80%， IFN-是由成纤维细胞受病毒或干扰素诱导剂产生的一种具有生物学活性的糖蛋白。 诱导IFN-产生的因素与诱导IFN-相同。 IFN-本身还可以诱生多种细胞因子，如诱生IL-1，而IL-1反过来又可以诱生IFN-、IFN-、IL-16、GM-CSF、TNF-等细胞因子，因此IFN-在细胞因子网络系统中发挥重要的调节作用。,3.1.1.4干扰素的生物学活性,1) 抗病毒活性 2) 抑制细胞增殖活性和抗肿瘤活性 3) 免疫调节活性,1) 抗病毒活性 IFN是机体抗病毒感染的第一道防线，在免疫系统发挥作用前使细胞形成抗
21、病毒状态，抑制病毒增殖，防止病毒扩散。,2) 抑制细胞增殖活性和抗肿瘤活性 无论是对转化细胞还是正常细胞的生长，IFN均具有抑制作用。 调节癌基因的表达是IFN抗肿瘤活性的一个重要机制。正常细胞向肿瘤细胞的转化过程在一定程度上受癌基因的调控，IFN能够抑制一些前癌基因的表达，从而选择性地减少癌基因的表达，阻止或减慢正常细胞向肿瘤细胞的转化过程。,3) 免疫调节活性 IFN对整个机体的免疫功能包括免疫监视、免疫防御、免疫稳定等均有不同程度的调节作用。,3.1.2 白细胞介素类,白细胞介素（interleukin,IL）是一类免疫调节因子。 这个名称是1979年在第二届国际淋巴因子研讨会提出的，意
22、指由各种白细胞产生的，介导细胞之间相互作用的细胞因子。 它们主要由激活的淋巴细胞分泌，作为免疫系统的细胞因子信使发挥作用。,3.1.2.1白细胞介素的种类、结构与特性,1）人IL-2 人IL-2主要由激活的T细胞和NK细胞产生的一种糖蛋白，又称T细胞生长因子，由133个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为1517.5Ku，pI 6.88.2。结构中有3个Cys58、Cys105、Cys125，仅在Cys58和Cys105之间形成分子内二硫键才有生物活性。 Cys125易形成二硫键错配，形成二聚体，降低甚至失去IL-2的生物学活性。将Cys125突变为丝氨酸或丙氨酸后，可改善其活性和稳定性。这种突
23、变体也已批准上市。,3.1.3 集落刺激生长因子,3.1.3.1 集落刺激生长因子的种类、结构及性质 1966年Bradey等人在进行造血细胞体外半固体培养时，发现一类蛋白质可刺激造血细胞集落形成，从而发现一组特异性的造血生长因子。 用集落培养方法发现的造血细胞生长因子称为集落刺激因子（colony stimulating factor,CSFs） CSFs不是单一成分，不同的CSF刺激生成由不同的细胞系组成的细胞集落。,严格讲，CSF主要是GM-CSF、G-CSF、M-CSF和Multi-CSF（或IL-3）4种。 GM-CSF：granulocyte-macrophage CSF，粒细胞巨
24、噬细胞集落刺激因子 G-CSF： granulocyte CSF，粒细胞集落刺激因子 M-CSF：macrophage CSF，巨噬细胞集落刺激因子 Multi-CSF （或IL-3）：多能集落刺激因子,维持细胞存活（细胞膜完整）； 刺激造血细胞增殖； 引导造血细胞分化定型； 刺激终末细胞的功能活性。,CSFs对效应细胞具有4种作用：,3.1.4 红细胞生成素,红细胞生成素（erythropoietin,EPO）,又称促红细胞生成素或红细胞生产刺激因子（ erythropoietic stimulating factor,ESF），是调节红系祖细胞、红细胞生成的主要激素。 1971年研究人员从
25、贫血羊血浆中纯化出羊EPO。 1977年Miyake从再生障碍性贫血病人的尿液中分离获得人EPO纯品，但含量甚微。,性质： EPO具有一定的酸稳定性和热稳定性，4可保存2年以上，耐有机溶剂，但对蛋白水解酶敏感，特别是对唾液酸酶更敏感，去除唾液酸的EPO完全失去体内生物学活性。 在人类胎儿和新生儿时期，肝脏是产生EPO的主要器官。成年期，EPO主要产生于肾脏，但肝脏仍保留产生EPO的能力。一些肿瘤细胞也能产生EPO。 机体缺氧和贫血能诱导产生EPO，钴盐、锰盐和雄激素等也能诱导产生EPO。,3.1.5 肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF） 早在19世纪
26、，人们发现某些肿瘤患者感染细菌后，常导致肿瘤缩小或自发消退。为此，1893年美国学者Coley开始使用被杀死的细菌混合物治疗癌症病人，此混合物被称为Coleys毒素。 1934年美国医学学会宣称Coleys毒素是当时全身性治疗癌症的惟一办法。由此引发出临床上采用菌苗抗癌的免疫疗法。,1971年Old等人发现，给感染BCG的小鼠注射LPS后，其血清中含有一种使小鼠肉瘤细胞出血性坏死的因子。 Carswell等报道经BCG感染的家兔两周后通过静脉注射大肠杆菌内毒素，2h内该家兔血清中便出现一种肿瘤细胞毒因子，这种因子能使动物肿瘤发生出血坏死，对正常组织细胞没有毒性。与内毒素不同的是，它在体外也能抑
27、制肿瘤细胞的生长。 实际上，内毒素的肿瘤坏死效应是通过单核-巨噬细胞系统介导的细胞毒作用而杀伤肿瘤的，其本身并无直接抗癌作用。,值得一提的是， TNF 和TNF 在杀伤肿瘤细胞的同时，都能诱导正常细胞和动物产生锰过氧化物歧化酶，保护正常细胞免受辐射或抗瘤药物的损伤，同时增加肿瘤细胞对辐射的敏感性，这对肿瘤放射治疗的效果及愈后有积极作用。,3.1.6 表皮生长因子,3.1.6.1 表皮生长因子的结构及性质 表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)首先是20世纪60年代从小鼠颌下腺中发现的一种活性多肽，它由53个aa组成，含3对二硫键，分子质量约6ku。 人表皮生长因
28、子，因其可抑制胃酸的分泌，又称抑胃素。,表皮生长因子的临床应用 中国科学院上海生化所成功地利用分泌型大肠杆菌系统表达了EGF，中国医学科学院基础医学研究所利用酵母体系高效表达了hEGF，两种体系表达的EGF均获得了新药证书（外用型） 1）促进外科手术伤口及创面愈合； 2）促进眼角膜创伤的愈合； 3）对胃肠道溃疡的治疗作用；,EGF的生物学作用广泛，对外胚层和内胚层来源的一些组织有促分裂和刺激合成的作用。EGF促进细胞增殖分化，存在内用安全性问题，故内用rhEGF至今未获批准临床应用。,3.1.7 干细胞因子,干细胞因子（stem cell factor,SCF）又称为干细胞生长因子（SCGF）
29、，肥大细胞生长因子（mast cell growth factor,MCGF），是1990年发现的一种重要的造血细胞因子。它在造血及维持肥大细胞、黑色素细胞和精原细胞的存活、增殖和分化过程中起着重要作用。 尤其是在干细胞移植、干细胞生物工程研究和应用迅速的今天，SCF在这一领域将占有其他细胞因子不可替代的重要地位，越来越受到生物学家和临床学家的重视。,血小板生成素（thrombopoetin,TPO），是血小板生成的主要生理调节因子，主要通过刺激巨核细胞分化、增殖及成熟来调节体内血小板的生成，故又称巨核细胞生长发育因子 （Megakaryocyte growth and development
30、 factor,MGDF）。,3.1.8 血小板生成素,糖基化与否并不影响IL-2的功能，故可以用大肠杆菌来生产重组人IL-2。 大肠杆菌表达的无糖基化的rhGM-CSF比天然糖基化GM-CSF具有更高的生物学活性，更长的半衰期和更强的结合受体亲和力。 糖基化与否对SCF的活性没有影响，这样可以用大肠杆菌表达体系来大量表达生产重组人SCF。 糖基对EPO的生物学活性是到至关重要的，因此基因工程的EPO只能利用哺乳动物细胞表达系统（CHO）生产 天然的TPO是高度糖基化的，糖基化有助于提高TPO的活性，还可延长其半衰期。,3.2.1 胰岛素,胰岛素insulin是最早（Banting和Best，
31、1921年）发现的一种具有激素作用的蛋白质，也是最先（Abel，1926年）结晶、确定氨基酸残基序列（Sanger等，1955年）、人工化学合成（Du等，1964年；龚岳亭等，1965年）以及采用基因工程技术批量生产并投放市场供应临床（1982年）的第一种蛋白质。,3.2.1.2 胰岛素的生物功能及临床应用,生物学功能 胰岛素具有非常广泛的调节细胞代谢等的生物学功能，是维持人体正常代谢和生存所必需的激素。 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。,1）调节糖代谢：胰岛素能够降低血糖； 2）调节蛋白质代谢：胰岛素通过增加肌肉等组织及细胞对氨基酸的提取，促进
32、核糖蛋白对mRNA的翻译，加速蛋白质的合成；胰岛素还可降低蛋白水解酶的活性，抑制蛋白质的分解代谢和氨基酸的氧化；,3）调节脂肪代谢：胰岛素能促进脂肪酸的合成和碳水化合物转换为脂肪。通过降低细胞内脂解酶的活性而抑制脂肪分解，使酮体生成减少，纠正酮症酸中毒。 4）其它功能：胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入细胞内；可促进DNA、RNA及ATP的合成。,3.2.4 心钠素及利钠多肽家族,心钠素（atrial natriuretic peptide，ANP） 人心钠素是由28个氨基酸残基组成的活性多肽，其分子中含2个半胱氨酸形成的二硫键，使ANP分子呈环状结构。 具有降压及减少血容量作用，并在维
33、持水电解质平衡及内环境稳定等方面扮演重要角色,3.3.1 链激酶,链激酶(streptokinase)是在1933年由Tillet和Garner首先在多株链球菌的培养液中发现的，也是最先用于临床治疗的溶栓药。 最初的药物是从-溶血性链球菌的培养液中提取的，产量低、成本高，而且制品中残存的溶血素对心肌和肝脏有一定的损害。 以后改用基因工程技术在大肠杆菌中表达的重组链激酶避免了该危害。,链激酶是一种非酶性单链蛋白，本身不能激活纤溶酶原，它的激活机制是间接的， 即先要与纤溶酶原以1：1的比例结合成链激酶纤溶酶原复合物，此时的复合物才能激活在纤维蛋白表面的或游离在血液中的纤溶酶原，使之成为纤溶酶，溶解
34、纤维蛋白。 该复合物的催化作用很快。,链激酶溶栓作用机理,纤溶酶原,激活剂前体,内皮细胞因子,纤维蛋白,链激酶溶血栓过程,1:1,activate,链激酶,尿激酶是直接起作用，且作用较慢， 它对纤维蛋白也无选择性，也容易引起出血等不良反应。 优点：但尿激酶价格低廉，不产生抗体，不引起过敏反应，在我国是主要的溶栓药。,3.3.3 组织型纤溶酶原激活剂,它是由Astrump等首先在组织中发现的，故被命名为组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA），人体很多组织均能产生t-PA，它主要由血管内皮细胞产生。 1983年Pennica等从Bowe
35、s黑色素瘤细胞系中提取了t-PA的cDNA，并在大肠杆菌中表达成功，但由于复性困难，未能形成产品。 1987年，美国Genetech公司用CHO细胞生产的t-PA，是第一个被美国FDA批准的用动物细胞大规模生产的基因工程产品。,t-PA是继链激酶和尿激酶之后属于第二代溶栓药，它与第一代溶栓药相比，优点在于对血栓的特异性溶栓作用。 游离的t-PA对纤溶酶原的亲和力很低，因此对血液中的纤溶酶原一般不会产生激活作用，而对纤维蛋白却有很强的亲和力，与纤维蛋白结合的t-PA对纤溶酶原的激活作用比游离的t-PA强100倍。 由于正常人的血液中很少有纤维蛋白，因此一般不会产生非特异性的全身性纤溶状态。,t-
36、PA,激活,3.3.4 水蛭素,19世纪80年代，有学者发现吸血水蛭含有一种具有抗凝性质的活性成分，将其暂命名为水蛭素（hirudin）， 直到20世纪50年代，随着蛋白质化学和血液凝固生物化学研究技术的发展，科学家才从汲血水蛭唾液腺分离出这种抗凝物质，正式命名为水蛭素。 水蛭素是由65个aa组成的活性多肽，是目前已知的最强有效的凝血酶抑制剂，是预防血栓形成的有效辅助药物。,已从水蛭素cDNA文库中分离出编码水蛭素的cDNA，在酵母菌中表达了有活性的水蛭素。 临床上防治血栓性疾病的药物有多种，其中包括抗血栓药物和溶栓药。水蛭素属于抗血栓药。 水蛭素是一种凝血酶抑制剂，直接作用于凝血酶，与凝血酶
37、形成稳定的特异复合物，阻断凝血酶的蛋白水解功能。,第四章 复习,抗体分子的结构CDR区,在V区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，称为互补决定区（CDR）。而C区则决定了Ig分子的异种抗原性。,改造鼠源性单克隆抗体的目的：,一是降低免疫原性； 二是降低相对分子量，增加组织通透性。,改造后的单抗的类型和特性,类 型 基本结构 相对分子质量,人-鼠嵌合抗体 人IgC-小鼠IgV 150000改形抗体 小鼠CDRs替换人CDRs 150000Fab 完整L链和Fd （VH+CH1） 50000FV VH和VL 25000 单链抗体 VH-多
38、肽-VL 27000 单域抗体 VH或VL 12500 最小识别单位（MRU） 一个CDR 2000,而具有完整抗原结合位点的Fab、Fv及ScFv是目前小分子抗体研究的重点。,4.3.4双功能抗体,双功能抗体就是双特异性抗体（biospecific antibody, BsAb）。 双功能抗体，是指一类具有双特异性的抗体杂合子，它们在功能上是单价的，化学结构是双价的。 双功能抗体具有双重特异性，这种新型抗体的两个Fab段能同时与不同的两个抗原结合。即抗体的一臂与肿瘤标记结合，另一臂则与药物、毒素或细胞毒性细胞结合，双功能抗体应用于辅助癌症的治疗，这些作用能直接导向瘤细胞.,噬菌体抗体库技术,
39、噬菌体抗体是在膜表面表达抗体分子Fab或ScFv，这种膜表达是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成， 其特点是它既可以识别相应抗原与其相结合，又能够感染宿主菌进行再扩增。 将B细胞全套可变区基因克隆出来，组装成噬菌体抗体的群体，则成为噬菌体抗体呈现技术。,诊断血清诊断方法,凝集反应：是指颗粒型抗原（如细菌或吸附在乳胶、离子交换树脂等不溶性的颗粒上的抗原），以及细胞型抗原（如红细胞或吸附在红细胞上的抗原）与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，可形成肉眼可见的凝集团块。,直接凝集反应(direct agglutination) 是将细菌或红细胞等颗粒性抗原与其
40、相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。 （1）玻片法（同种红细胞凝集反应） 如检查血型的血细胞凝集现象 （2）试管法 如诊断伤寒病的肥达氏反应（Widal reaction）,2、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂,将抗体吸附于载体上（常用红细胞），用以检测抗原的间接凝集反应，其与传统的间接凝集反应（抗原吸附于载体上）相反，称为反向间接凝集反应。该方法用红细胞作为载体时，称为反向被动血凝试验。 试剂制备的原理：血细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBsAg血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生
41、凝集。,反向被动血凝试验,3、妊娠诊断试剂,人体绒毛膜促性腺激素 （Human Chorionic Gonadotropin，HCG） 成熟女性因受精的卵子移动到子宫腔内着床后，形成胚胎，在发育成长为胎儿过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的HCG，可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。当妊娠12.5周时，血清和尿中的HCG水平即可迅速升高，第8孕周达到高峰，至孕期第4个月始降至中等水平，并一直维持到妊娠末期。,间接凝集反应(indirect agglutination) 是用可溶性抗原包被在一种与免疫无关的，具一定大小的不溶性颗粒（即载体颗粒，如：乳胶颗粒或红细胞）的表面，然后与相应抗体作用，在有适
42、宜电解质存在的条件下，结合产生的凝集现象。,间接凝集抑制试验：将可溶性抗原与相应抗体预先混合，充分作用后，再加入相应致敏颗粒，此时因抗体已被可溶性抗原结合，不再能与致敏颗粒表面相应抗原结合，故不能出现致敏颗粒被动凝集的现象。,4、抗ABO血型系统血清,按人红细胞表面带有的A或B种凝集原，可将血型分为A、B、AB和O型4种。 ABO血型抗血清的制备 血型鉴定的方法：玻片直接凝集方法,抗B凝集素和抗A凝集素,人血型的常规ABO分型,人红细胞与血清的反应 人血清与红细胞的反应 解释抗A血清 抗B血清 A细胞 B细胞 O细胞 ABO血型,- - + + - O+ - - + - A- + + - -
43、B+ + - - - AB,毒素的来源,植物毒蛋白及其A链类似物（也称核糖体失活蛋白，RIP），以及细菌毒蛋白。 常用的毒素有： 细菌毒素：白喉毒素（DT）、绿脓杆菌外毒素（PE） 植物毒素：蓖麻毒素、相思子毒蛋白。,这些毒素的特点：在进入胞浆后，能使蛋白质生物合成停止，从而使细胞死亡。它们都是高效的细胞毒剂，理论上只要1、2个毒蛋白A链分子进入胞浆，即可杀死一个细胞，因此它们是“生物导弹”相当理想的 “弹头”。,植物毒素A 链能催化真核细胞核糖体60S 亚基的失活，使核糖体失去与肽链延伸因子2结合的能力，从而使蛋白质生物合成停止。 植物毒素B链能与细胞表面多糖的半乳糖残基结合，并插入细胞膜，
44、形成孔道，帮助A 链进入胞浆。 毒素 A、B链之间由二硫键相连。 当毒素与细胞表面结合后，细胞膜内凹，形成吞噬泡，然后经高尔基体，转到溶酶体 中。在这过程 中，一部份毒素A链可能在B链帮助下，穿过膜进入胞浆，使蛋白质合成停止，其他毒素分子可能为溶酶体内的水解酶降解。,第五章 复习,5.2.1动物细胞的形态,动物细胞结构 细胞形态的分化（特化） 离体培养细胞类型：贴壁细胞、悬浮细胞、兼性贴壁细胞,5.5.1动物细胞大规模培养的方法,悬浮培养 贴壁培养 贴壁悬浮培养，或称假悬浮培养,5.5.2动物细胞培养的操作方式,分批式操作 半连续式操作 连续式操作 灌流式操作,1、分批式操作,一种是将细胞和培
45、养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。 另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出，如产生Namalwa干扰素和疫苗等。,3 连续式操作,连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上
46、讲，该过程可无限延续下去。,4、灌流式操作,该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。 它与半连续式操作不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而半连续式培养则同时也取出了部分细胞。 该操作方式是近代用动物细胞培养生产各种药品最被推崇的方式。,5.6.1动物细胞生物反应器的类型及其基本结构,搅拌罐式生物反应器 气升式生物反应器 中空纤维式生物反应器 透析袋或膜式生物反应器 固定床或流化床式生物反应器,ATryn（-antithrombin）-首个转基因动物生产的药物获准上市,2009-11-
47、10 16:04:12 作者：新特药房 来源：中国新特药网 美国麻省生物技术公司（GTC Biotherapeutics）ATryn：人抗凝血酶重组蛋白，它是第一个在世界上得到认可的转基因动物生产的蛋白。 GTC生物治疗公司正在开发人类血浆蛋白的重组蛋白、单克隆抗体。 这些产品可能应用于血液学、肿瘤学和自身免疫疾病。 ATryn是从经过基因修饰的奶山羊分泌出的羊奶中提取纯化，它是用于治疗遗传性抗凝血酶缺乏症的疾病。,第六章 复习,6.2.3根据抗生素的化学结构分类 (1) -内酰胺类抗生素 包括青霉素类、头孢菌素类等。它们都包含一个四元内酰胺环。这是在当前通受重视的一类抗生素。 (2)氨基糖苷
48、类抗生素 包括链霉素、庆大霉素等。,6-APA,(3)大环内酯类抗生素 如红霉素、麦迪加霉素。 (4)四环类抗生素 如四环素、土霉素等。 (5)多肽类抗生素 如多粘菌素、杆菌肽等。它们多由细菌、特别是由产孢子的杆菌产生，,6.2.4根据抗生素的作用机制分类 (1)抑制细胞壁合成的抗生素 如青霉素、头孢菌素。 (2)影响细胞膜功能的抗生素 如多烯类抗生素。 (3)抑制病原菌蛋白质合成的抗生素 如四环素。 (4)抑制核酸合成的抗生素 如丝裂霉素C。 (5)抑制生物能作用的抗生素 如抑制电子转移的抗霉素(antimycinl)。,提取精制：将青霉素发酵液冷却，过滤。 滤液在pH22.5的条件下，于萃取机内用醋酸丁酯进行多级逆流萃取，得到丁酯萃取液，转入pH7.07.2的缓冲液中，然后再转入丁酯中， 将此丁酯萃取液经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得青霉素G钾盐。 青霉素G钠盐是将青霉素G钾盐通过离子交换树脂（钠型）而制得。,
