1、免疫组织化学Immunocytochemistry ICC,免疫组织化学,免疫细胞化学又称免疫组织化学、其主要原理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。,免疫细化学的基本理论,抗原抗体反应 标记化学反应 显色化学反应,抗原抗体反应,抗体是免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。人类免疫球蛋白有五类，即IgG 、IgA、 IgM、IgD 及IgE。 人体内的五类 Ig之间的区别就在于其各自重链的氨基酸组成和抗原性不同。用小写希腊字（Gamma）、(Alpha)、(Mu)、(
2、Delta)、(Epsilon),分别表示IgG 、IgA、 IgM、IgD 与IgE的两条重链。,免疫组织化学特点,1.高度特异性 2.敏感性高 3方法步骤统一 4形态、机能和代谢密切结合,基本技术方法,抗体的制备 组织材料的处理 免疫染色 对照试验 显微镜观察,免疫组织化学分类,根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为: 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术 免疫电子显微镜技术,免疫酶细胞化学,预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。,酶的种类,辣根过氧化物酶（Horseradish pero
3、xidase , HRP）碱性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP） 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）,酶的要求,酶催化的底物必须是特异、容易观察； 定位效果好； 易获得，最好有商品出售； 酶的催化活性（Turnover）高并且稳定； 酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性； 背景低：被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。,基本步骤,组织及切片制备 抗体的制备 切片封闭：血清等 与抗体孵育 加入显色底物显色 复染 观察,抗体制备,酶标抗体 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体。再借酶对底物的特异催化作用显色
4、。 非标记抗体酶法,酶桥法,抗过氧化物酶法（ PAP ）,PAP法的评价,抗体活性高 灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。 背景染色低：,亲和免疫细胞化学技术,物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础 。 抗原与抗体 植物凝集素和糖类 生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素和受体等,亲和免疫细胞化学技术特点,亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原（或抗体 ）在细胞或亚细胞水平的定位。,抗生物素生物素免疫细胞化学染色法,基本原理 生物素 （Riotin）：是一种小分子的维生素 卵白素（Avidin）：又名亲合素，鸡蛋
5、白中一种碱性蛋白。 生物素与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。 生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。,抗生物素生物素染色法,1抗生物素生物素过氧化酶复合物技术（Avidin Biotin Peroxidase Complex technique, 简称ABC技术） 2桥抗生物素生物素技术（Bridged Avidin Biotin technique, 简称BRAB技术） 3标记生物素抗生物素技术（Labelled AvidinBiotin technique, LAB技术）,桥抗
6、生物素生物素技术（Bridged Avidin Biotin technique, 简称BRAB技术）,一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：卵白素三抗：生物素标记的酶,操作步骤,固定： 生物素标记的第一抗体，室温孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 第二抗体卵白素，孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 生物素标记的酶孵育作用15min 。 PBS洗 5min，更换3次。 显色。 复染封片、观察。,标记生物素抗生物素技术（Labelled AvidinBiotin technique, LAB技术）,一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：酶标记抗生物素,切片在含有2550g/m
7、l生物素标记抗体（PBS液稀释）中孵育1h，室温。 PBS洗2次，每次5min。 用2050g/ml过氧化物酶标记的抗生物素液孵育90min，水洗。 酶呈色反应。,设计对照实验,设计对照实验目的： 证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照。 阳性对照； 阴性对照；,阳性对照,用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。,阴性对照,没有信号出现的检测结果。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴
8、性结果； 用没有交叉反应的抗体代替特异性抗体进行实验。 用特异性抗体的抗血清与特异性抗体与切片共同孵育；,免疫细胞化学结果的判断,判断特异性染色和非特异性染色。 要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验。 重复,免疫组化检测action蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。请选择抗体组合，设计实验。 人抗大鼠action（同种型IgG ） 大鼠抗人action （同种型IgG ） 兔抗大鼠action （同种型IgG ） 生物素标记的兔抗人IgG 生物素标记的兔抗人IgM 生物素标记的人抗兔IgG 生物素标记的人抗兔IgM 碱性磷酸酶标记的卵白素 碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG,
