1、第二十二章 高效液相色谱法 high performance liquid chromatography,中药化学与分析教研室,本章内容介绍,第一节 概 述 第二节 高效液相色谱仪 第三节 高效液色谱法的基本理论 第四节 各类高效液色谱法 第五节 固定相 第六节 流动相 第七节 HPLC分析条件的选择 第八节 定性与定量分析 第九节 LC-MS联用技术简介 第十节 超临界流体色谱法简介,第一节 概 述,HPLC是在经典液相色谱基础上引入GC的理论和技术,采用： 高速高压泵 高效固定相； 高灵敏度检测器,HPLC与经典液相色谱的比较,高 速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只
2、需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高 效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高 灵敏度：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测器10-11g。,HPLC 和GC的比较,流动相：HPLC 液体种类多，可选范围多GC 气体，种类少，改变载气影响柱效和分离少 固定相：HPLC 新型吸附剂，化学键合相，粒度小GC 吸附剂，担体+吸附剂，粒度大 应用范围：HPLC 高沸点，难挥发，对热不稳定物质GC 低沸点，易挥发，对热稳定物质此外，HPLC流出组分可以收集，检测器灵敏度高。,高效液相色谱仪,第二节 高效液相色
3、谱仪,HPLC仪组成：输液系统; 进样系统; 分离系统; 检测系统; 数据处理系统。,流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,主要部件,输液系统 （一） 流动相贮器耐酸碱的瓶子（棕色或无色），高于泵体，保持输液静压差。,（二）脱气装置液体流动相使用前要脱气，除去其溶解的气体。（基线噪音，氧化组分！） 方法： （1）超声波振动脱气 （2）抽真空脱气 （3）加热回流脱气 （4）吹氦脱气 （5）真空在线脱气,(三) 高压输液泵 要求：流量准确可调，耐高压（30M Pa ），液流稳定，泵的死体积小 。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m）
4、，液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,双泵串联补偿法将两个柱塞杆往复泵串联,泵1比泵2体积大一倍,柱塞杆运动方向相反。（目的是：减少输液脉冲）,(四)梯度淋洗装置,梯度洗脱：分离过程中，随时间函数程序地改变流动相的组成（极性，PH或离子强度）。类型：高压梯度低压梯度,外梯度（二元高压梯度）: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度（四元低压梯度） :一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,二. 进样系统,（一）六通进样阀流路中为高压
5、力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,优点： 进样精确，重现性好。,三. 色谱分离系统,（一）保护柱 位置：接在色谱柱之前，保护色谱柱。 柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长5 cm。填料跟分析柱一样，粒径大。,（二）色谱柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 常用的分析柱是内径24.6mm，柱长1025cm,（三）柱恒温箱,精确控制柱温可以提高保留时间的重现性。柱温升高，保留时间减少。 常用温度：室温-65度,（四）色谱柱柱效的评价,中国药典05版规定：建立HPLC法时，需要进行“色谱条件与系统适应性”
6、实验。最佳分离状态下色谱柱应达到的： n理论？ 分离度R？ 拖尾因子T？,四. 检测系统,检测器：检测器分为溶质性检测器（只对流动相中的被分离分析组分的物理或物理化学性质有响应）和总体型检测器（对流动相的总的物理或物理化学性质有响应）。（1）溶质性检测器：紫外（UVD）、荧光（FLD）、电化学（ECD）检测器等。,紫外检测器基于被测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，且吸收符合光吸收定律。因此可以进行定性定量分析。 a固定波长型检测器是一种光源波长固定的紫外光度计，一般由低压汞灯作光源，发射波长为254nm波长的光。对在254nm波长附近有吸收的物质有响应。b可变波长型检测器是一台紫外可见分光
7、光度计，波长任意可调。,a. b. 紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,c. 光电二极管阵列检测器（PDAD）,一种新型记录方式的紫外检测器，紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器组成：它由光源、光栅、 1024个二极管阵列（各检测特定波长），计算机。光源发射的光被组分选择性吸收，经光栅分光后照射到二极管阵列上，使每纳米光波的光强变成相应的电信号，经累积和计算机处理后得到试样或每个组分的吸收光谱。可以获得t、A、的三维图光谱和色谱
8、图的加合图。,光电二极管阵列检测器,光电二极管阵列检测器 应用,三维时间-色谱-光谱图 除了定量外，可以综合定性分析:(1)色谱峰的纯度检查 (2) 色谱峰的分离状况,（二）蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector, ELSD,ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。ELSD属通用型和质量型检测器由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光电转换器等部件构成。,检测过程：,流出液 雾化成微细液滴 通过加热漂移管时 溶剂被蒸发掉，留下溶质 激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。散射光强度正比组分的量
9、,蒸发光散射检测器ELSD 应 用,散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，ELSD属通用型和质量型检测器。 适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。（糖类，甾体皂甙，脂肪酸等） 其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。,（三） 荧光检测器 （fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性；能在紫外光激发下能产生荧光的物质。多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,（四） 示差折光检测器 （differential refr
10、active index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。 差值与浓度呈正比,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；,五 数据处理系统,记录仪+工作站六 仪器性能指标分离性能：流量精度，噪声，漂移，线性检测性能：比如UV有波长的准确度,第三节 高效液色谱法的基本理论,基本理论及色谱流程与气相色谱法相似；如塔板理论、速率理论、保留值、分离度等都可用于高效液相色谱法。两者不同的是流动相，因而在基本理论方面需要考虑这些特点。其影响最大的是速率理论。 描述其板高与影响因素关系的范氏方
11、程如下：,涡流 纵向 传质阻力,HAB/uCu,但在液相色谱中流动相是液体，黏度大，柱温低，扩散系数小，所以B/u很小可以忽略，则：HACu 因此： （1）从A项考虑： A = 2dp 减小dp，小粒固定相，可以提高柱效；降低 采用球形，颗粒均匀分布的固定相，有利于提高柱效；,（2）从C项考虑： 在HPLC中： C=Cm+Csm+Cs 通常采用化学键合相，固定液被键合到载体的表面。所以C=Cm+Csm HA+Cm+Csm 范式方程提高柱效的方法： （1）减小dp，采用球形小粒固定相，化学键合相（2）低黏度流动相，低流量（1ml/Min）（3）柱温25-30,第四节 各类高效液色谱法,一 、 液
12、-液分配色谱法 二、 液-固吸附色谱法 三、 离子交换色谱法 四、 离子色谱 五、 离子对色谱 六、 排阻色谱色谱,一、 液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，采用化学键合固定相 （一）正相分配色谱 亲水性固定液+疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性； 分离物质：强极性化合物（糖类和多肽类）；极性大的后出峰；氰基化学键合相：诱导力，分离可极化的物质氨基化学键合相：诱导力+氢键作用力,（二）反相分配色谱 疏水性固定液+亲水性流动相，流动相的极性大于固定液的极性。 分离物质：非极性化合物（广泛）；
13、极性小的后出峰；十八烷基键合相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（ ODS反相柱）。 疏溶剂理论：烃基键合相，强疏水性，组分中非极性部分与烃基键合相结合。亲水性流动相使组分分离。,二、 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用： 分离相对分子质量中等的脂溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的
14、拖尾；,三、 离子交换色谱 ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；早期采用的离子交换树脂被离子键合相代替。流动相： 阳离子离子交换色谱，采用碱性水溶液； 阴离子离子交换色谱，采用酸性水溶液；,基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-应用：离子及可离解的化合物，有机和无机分离，氨基酸、核酸等。,四、 离子色谱 io
15、n chromatography （IC）,离子色谱是与离子交换色谱的区别：采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。,一、离子色谱法原理,以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象, 在七十年代出现、八十年代迅速发展。,传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。,离子交换原理，与传统离子交换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；,低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离
16、柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。,2.离子色谱具有以下优点,（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；,（2）分离能力高在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。,（3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱,离子色谱装置类型,抑制型：抑制柱型、连续抑制型,非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量，使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离
17、柱相连，不需抑制柱。,离子色谱抑制装置图,阴离子交换： RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-,离子色谱连续抑制原理图,离子色谱的应用,阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。,五、 离子对色谱 ion pair chromatography,原理：将一种与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配
18、，从而控制被分离组分的保留值的色谱法。（LLC法基础上演变来的！）A+ + B- = (A + B- )org离子对的体积较大，又无净电荷，所以有显著的疏水性； 离子有亲水性，离子对有疏水性（亲油性）； 故可将萃取原理用来讨论离子对色谱的分离问题。,选择合适的反离子和浓度，就能有效地将被分离组分萃取进有机相。 正相离子对色谱：如以水作为固定相，有机溶剂为流动相，离子对容易流出色谱柱； 反离子对色谱：反之，则离子对被保留。常用离子对试剂： 阴离子分离：常采用烷基胺类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲胺作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；,六、 排阻色谱色谱 s
19、ize- exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。VRV0 +K Vi 流动相：四氢呋喃、二甲基甲酰胺等）。 应用：可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,七、 胶束色谱（MC）,流动相：胶束水溶液，多了一个胶束相，所以有三个界面，三个分配系数，有比较好的选择性。,HPLC固定相：硅胶，化学键合相，凝胶，离子交换剂一. 硅 胶吸附色谱常用，应用广（极性至弱极性物质
20、）。 类型：表面多孔硅胶，无定形全多孔，球形全多孔，堆积硅珠,第五节 固定相,表面多孔,二化学键合相以硅胶为载体，经化学反映后，将固定液的官能团键合在载体的表面上。化学键合相优点： （1）减少固定液的流失，增加色谱柱的使用寿命； （2）化学稳定，PH2-8溶液 （3）传质快，柱效高，载样量大封尾：化学反应将载体表面硅醇基出去。,键合类型： 硅氧碳型（Si-O-C）键合相醇与硅羟基进行酯化反应得到；易发生水解，目前少用。, 硅氧硅碳型（Si-O-Si-C）键合相硅羟基与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应得到，稳定多用：,键合类型有：,（一）非极性键合相 疏水基团不同链长的烷基，甲基和苯基等； 最广：十八
21、烷基键合相（C-18柱或ODS柱） ：将十八烷基通过化学反应键合到硅胶（担体）表面上。 影响因素： 1.载体性质：比表面大，键合基团多，k大，t长YWG-C18 ， YQG-C18 2.表面覆盖度：表面覆盖度大，残留硅醇基少，则分配占主导地位。 3.键合基团的链长： 链长增加，极性低，k大,载体,官能团,（二）中等极性键合相醚基键合相（ROR），如：YWG-ROR （三）极性键合相分析糖类极性基团 氨基、氰基、醚基和醇基等；（1）氰基化学键合相：中强极性 YWG-CN（2）氨基化学键合相：强极性 YWG-NH2三. 凝 胶 （一）半硬质凝胶：苯乙烯和二乙烯苯交联，压缩性，易装柱 （二）硬质凝胶
22、： 多孔硅胶等无机材料，易碎，柱效低 （三） 主要性能参数：分子量排斥极限，平均孔径原则：全渗透点的分子量样品分子量分子量排斥极限,四. 离子交换剂离子键合相 阴离子交换基团胺基、季铵基、阳离子交换基团磺酸基。 以含有离子交换基团（磺基、氨基、羧基等）的键合相为固定相。 例如:YWG-SO3H,YWG-R3NClZipax-SCX(薄壳型阳离子键合相),一. HPLC对流动相的要求：不与固定相发生不可逆化学变化；溶解样品；与检测器相配；粘度小，有利于获得高柱效；廉价、毒性小、易于纯化等。选择原则： “相似相溶”。试样极性、固定相极性及流动相极性之间的配合与经典色谱法相似。,第六节 流动相,二.
23、 常用流动相溶剂的性质 （一）沸点（b.p）：低沸点 （二）黏度：黏度太大，C项大，柱效低 （三）互溶性：好 （四）极性：用罗氏常数描述。调节极性可以使样品组分的k在合适范围。 极性参数P: Pab=aPa+ bPb极性参数与k关系:k2/k1=10 (P1-P2)/2 (正相色谱)k1/k2=10 (P1-P2)/2 (反相色谱),三. 溶剂的选择性与分类 四. 不同色谱选不同流动相 (一)吸附色谱用流动相通过实验选择。(二)分配色谱用流动相: 指导原则1k10 正相:最常用的流动相：饱和烷烃，如已烷，庚烷 反相:最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。 水甲醇体系：大约50水的
24、时候粘度最大 水乙腈体系：35水的时候粘度最大。,(三)离子交换色谱用流动相缓冲溶液，可以解离离子。(四)尺寸排阻色谱用流动相不需要改变流动相组成来改变分离，只要流动相能溶解样品，黏度低就可以。,第七节 HPLC分析条件的选择,一.分离条件的选择 (一)分离方法的选择,考虑分离方法的选择，主要考虑以下三个方面：（1）相对分子量 分子量小于200的一般选用气相法；2002000的选用液液、液固、或离子交换色谱法；大于2000的可用排斥色谱法。（2）溶解度 水溶性样品最好用离子交换或液液分配色谱法；微溶于水的，但在酸、或碱存在下能很好离解的，可用离子交换色谱法；油溶性、或相对极性较弱的混合物，可用
25、液固色谱法。（3）化学结构 离子型、或易离子化、或易形成离子对的化合物宜用离子色谱法；异构体的分离，宜用液固色谱法；同系物的分离，宜用液液分配色谱法；高分子化合物宜用排阻色谱法。,(二) 梯度洗脱分离指导原则是组分:1k10 等度洗脱（流动相比例不变）:样品组分少，性质差别不大。梯度洗脱：一个分析周期内，程序控制流动相的组成（极性，PH，离子强度）改变，使每个组分都能在适宜条件下分离。跟GC程序升温作用相似。适用：多组分复杂样品。优点：缩短分析时间，提高分离度R，改善峰形，提高灵敏度。,二. 检测器的选择,选择UV，ELSD，荧光，电化学检测器？根据前面所讲的内容总结。三. 色谱条件的评价 （
26、一）理论塔板数（n） （二）分离度 R （三）重复性 重复进标准品5针，计算峰面积的 RSD2.0% （四）拖尾因子 T （0.95-1.05）,第八节 定性与定量分析,一.定性分析 （一） 保留值定性 在一定操作条件下，各组分的保留时间是一定值。（二）化学鉴定法收集分离后组分定性。（三）HPLC-光谱联用技术HPLC-MS，HPLC-FTIR，HPLC-NMR,二. 定量分析,与GC差不多。 （一）外标法：以试样的标准品作对照物质，与对照物质对比求算试样含量的方法。标准曲线法 ， 外标一点法，外标二点法。用六通阀进样，进样误差小，故HPLC常用外标法。 （二）内标法 1.标准曲线法 Ci=b
27、Ai/As+a 2.内标对比法（内标一点法）,第九节 LC-MS联用技术简介,LC-MS技术飞速发展： 一. 接口技术主要是去除溶剂并使样品离子化。大气压电离源（API）： （1）电喷雾电离源（ESI） （2）大气压化学电离源（APCI）LC-MS分离过程： 样品经色谱分离，由ESI 或APCI离子化，进入MS分析。,LC-MS,应用,（一）定性分析提供未知化合物的分子量，高分辨率的如飞行时间TOFMS可以得到化合物的信息。（二）定量分析与HPLC方法差不多。采用与待测组分对应的特征离子得到的质量色谱图，减少干扰。,本章内容复习,第一节 概 述 第二节 高效液相色谱仪 第三节 高效液色谱法的基本理论 第四节 各类高效液色谱法 第五节 固定相 第六节 流动相 第七节 HPLC分析条件的选择 第八节 定性与定量分析 第九节 LC-MS联用技术简介 第十节 超临界流体色谱法简介,作 业,P 330-331 8-12,温馨提示 期末复习开始了! 下周窜讲色谱部分,所以请大家好好复习吧!,
