食品酶学实验指导书.doc

1、食品酶学实验指导书陆剑锋、孙汉巨2009 年 03 月实验一 果胶酶的特性及其应用一、实验目的1. 掌握果胶酶活性的检测方法；2. 了解与掌握果胶酶的特性；3. 了解果胶酶在果汁澄清中的作用；二、实验原理果胶质是指植物中呈胶状的聚合碳水化合物，是植物细胞间层和细胞壁的重要组分。果胶质由三种化学成分：-l，4-聚-D-半乳糖醛酸、阿拉伯聚糖和 -1，4-D-半乳聚糖。果胶质按其分子中 D-半乳糖醛酸上羧基酯化程度不同，可分为原果胶、果胶酸和果胶酯酸。果胶是多缩半乳糖醛酸甲酯，为白色或黄褐色的粉末，溶于 20 倍的水则成粘稠状液体，与三倍或三倍以上的砂糖混合，更易溶于水，对酸性溶液较对碱性溶液稳定

2、，不溶于乙醇及其它有机溶剂。果胶酶(EC.3.2.1.15)是分解植物主要成分果胶质的酶类，与纤维酶相似，是一群酶，至少有 8种酶分别作用于果胶分子的不同位点，基本上分为解聚酶和果胶酯酶两大类。前者能催化果胶解聚，后者能催化果胶分子中的酯水解。果胶水解酶澄清果汁分两步完成。首先由果胶酯酶切断果胶的甲酯基，生成果胶酸和甲醇，紧接着液化型的果胶酸酶使果胶质低分子化，生成带羧基的产物。多数羧基会与金属离子或其他成分结合而凝聚。这是可能发生二次沉淀的原因。果胶酶广泛地分布于高等植物(胡萝卜、番茄、草莓、香蕉、桔子等)和微生物中。果胶裂解酶的生产局限于霉菌。其高产菌株多为曲霉和青霉属。解聚酶来自于霉菌、

3、细菌等微生物和胡萝卜等植物中。果胶酯酶除在水果和蔬菜中存在外，在细菌相霉菌亦有发现。能引起橙、梨、苹果和香蕉腐败的微生物基本上都能产果胶酶，因为这些水果中果胶含量高。有利于分解果胶的微生物的生长和发育。虽然有不少微生物都能产果胶酶，但在工业生产中常采用真菌，例如产酶活力高的曲霉、青霉、核盘霉等。果胶酶主要应用于食品工业，特别是水果加工。由于果汁粘度高，致使过滤困难和产率低。果实经破碎后榨汁，果胶溶出在果汁内，造成果汁浑浊，在储存中又会发生沉淀。利用果胶酶分解果汁中的果胶，是果汁和果酒澄清的最好方法，已广泛应用于苹果汁、葡萄汁、草莓汁和柑桔汁等的生产。果胶酶的加量按成品酶活力而定，一般为 0.0

4、03-0.1，在 pH 值为 3-5, 3555条件下作用2-12h。用前以果汁或水将酶稀释 10-20 倍。果浆用酶和果汁用酶均不能与酶同时使用膨润土、多酚物质和 SO2（浓度要小于 500mg/L） 。为了检查澄清效果，可将一份果汁与二份（95%乙醇 99浓盐酸 1）混合液混合均匀，15 分钟后观察，果胶分解完全则无絮状物出现。贮存：本品最佳贮藏条件为 4-10，一般为室温贮藏，避免阳光直射。三、实验材料与仪器橘子等，果胶酶，95%乙醇。721 分光光度计；恒温水浴；离心机；移液管 0.5、5 毫升；离心管；温度计；试管；试管架；玻璃烧杯；比色管。四、操作步骤（一）温度对果胶酶活力的影响1

5、取 9 支比色管，分别放入约 10 毫升橘汁，再分别加入 1%浓度的果胶酶（0、0.1、1）毫升，再补加蒸馏水至总体积 22 毫升。充分摇匀，置恒温水浴中于 35、45、55温度下反应 2 h。2反应结束后，将反应液放入离心管中进行离心分离（3000rpm，5min） 。3取上清液用蒸馏水稀释 5 倍后于 721 分光光度计于 600nm 处测吸光值。4计算果汁澄清度（%）=（OD 对照 -OD）OD 对照 100式中：OD 对照 对照的吸光值（用蒸馏水代替酶液，与反应液同样操作） ；OD酶反应液的吸光值。5根据在三个温度下果汁的澄清度的比较，取澄清度最高的温度为最适温度（见表 1-1） 。表

6、 1-1 温度对果胶酶活力的影响实验序号 温度（） 果汁澄清度（%） 结 果1 23354 56457 8955（二）pH 值对果胶酶活力的影响1取 9 支比色管，分别放入约 10 毫升橘汁，再分别加入 1%浓度的果胶酶（0、0.1、1）毫升，每 3 个比色管分别补加 pH 为 3、4 和 5 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液至总体积 22 毫升。充分摇匀，置恒温水浴中于 45温度下反应 2 小时。2反应结束后，将反应液放入离心管中进行离心分离（3000rpm，5min） 。3取上清液用蒸馏水稀释 5 倍后于 721 分光光度计于 600nm 处测吸光值。4计算果汁澄清度（%）=（OD 对照 -OD）

7、OD 对照 100式中：OD 对照 对照的吸光值（用蒸馏水代替酶液，与反应液同样操作） ；OD酶反应液的吸光值。5根据在三个 pH 下果汁的澄清度的比较，取澄清度最高的 pH 为最适 pH（见表 1-2） 。（三）加酶量对果汁澄清的影响以横坐标为添加的酶量，纵坐标为澄清度，作坐标图。用上述方法测定时，果汁的澄清度与酶量之间的关系在澄清度 80%以下时，基本上近似直线，澄清度在 80%时，肉眼也能看到几乎是透明的，因此将此作为反应终点。把添加 0.1 毫升和 1 毫升分别的澄清度，在坐标图上连接起来。找出澄清度达到 80%时的最少使用酶量作为所需酶量。（四）果胶酶活力的确定在（三）的条件下，能使

8、 1 毫升果汁有 80%澄清的酶活力定为 1 单位。酶澄清果汁的活力（/ml）= dV5式中：d酶的稀释倍数；V所需酶量（ml） 。（五）果汁中果胶的检验分别取在不同条件下作用 2 小时的果汁 2.5 毫升置比色管中，加入 95%乙醇至总体积 10 毫升，振荡。因果胶不溶于乙醇中，如有果胶存在，则有浑浊和沉淀生成，比较浑浊生成量，可知果汁经果胶酶澄清效果。表 1-2 pH 值对果胶酶活力的影响实验序号 pH 果汁澄清度（%） 结 果1 2334 5647 895五、附录：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L） ，3.06.20.1mol/L 柠檬酸：含 C6H8O7.H2O 21.01g/

9、1000ml；0.1mol/L 柠檬酸三钠：含 Na3C6H5O7.2H2O 29.40g/1000ml。pH0.1mol/L柠檬酸(xml)0.1mol/L柠檬酸三钠(yml)pH0.1mol/L柠檬酸(xml)0.1mol/L柠檬酸三钠(yml)3.03.23.43.63.84.04.24.44.682.077.573.068.563.559.054.049.544.518.022.527.031.536.541.046.050.555.54.85.05.25.45.65.86.06.240.035.030.525.521.016.011.58.060.065.069.574.579.08

10、4.088.592.0实验二 多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活力的测定一、目的掌握多酚氧化酶及抗坏血酸氧化酶的测定方法。二、原理测定果实、蔬菜保鲜中氧化酶的动态，对了解植物的代谢情况及其与环境条件的关系有重要意义。抗坏血酸氧化酶会使抗坏血酸氧化而变成黄褐色的脱氢抗坏血酸；多酚氧化酶使焦儿茶酚（邻苯二酚）氧化产生黑素类，使果实蔬菜在不适宜的贮藏条件下品质变劣。抗坏血酸氧化酶的测定是在该酶的最适 pH 及适宜温度下，向反应瓶中加入一定量底物（抗坏血酸及酶液） 。根据抗坏血酸的消耗量计算酶活力。抗坏血酸消耗量可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。KIO3 十 5KI2H 3PO43I 2 十 2K3PO4

11、十 3H2O抗坏血酸十 I2脱氢抗坏血酸十 2HI在氧的存在下，多酚氧化酶将邻苯二酚氧化为醌类，醌又进一步氧化抗坏血酸为脱氢抗坏血酸。向反应系统中加入焦儿茶酚和抗坏血酸，可由抗坏血酸的消耗量间接求得多酚氧化酶的活力。三、材料、仪器和试剂l材料新鲜的马铃薯或苹果等。2仪器电冰箱，组织捣碎机，恒温水浴锅，离心机，三角瓶 50 毫升（6） ，刻度吸管 5 毫升（1） 、2毫升 1（2） 、1 毫升（2） ，微量滴定管（2） ，秒表。3试剂(1) pH6、0.05M 磷酸盐缓冲液（0.2M Na 2HPO4 12.3ml，0.2M NaH2PO4 87.7ml，稀释 4 倍）(2) 0.1%抗坏血酸

12、使用当天配制。(3) 0.02M 焦儿茶酚（邻苯二酚） 称取 0.22 克焦儿茶酚溶于 100 毫升水中，使用当天配制。(4) 10%偏磷酸(5) 1%淀粉溶液(6) 0.005M 碘液 碘化钾 2.5 克溶于 200 毫升蒸馏水中，加冰醋酸 1 毫升，再加 0.1M 碘酸钾（0.3567克碘酸钾溶于水，定容至 100 毫升）12.5 毫升，用蒸馏水定容至 250 毫升。四、操作1.酶液制备将新鲜马铃薯或苹果 8 克（去皮） ，切碎后置组织捣碎机内，加入约 60 毫升左右 pH6 的磷酸盐缓冲液（预先置冰箱内冷却） ，捣碎 3 分钟后将全部材料用缓冲液洗入 100 毫升容量瓶内，并定容至刻度。

13、在 20水浴上浸提 30 分钟，中间摇动数次。将匀浆离心（2500 转/分，1015 分钟） ，取出上清液（酶液）备用。2. 测定取 6 个 50 毫升干燥的三角瓶，标号后按下表准确加入试剂。抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶测定试剂加量表试剂(毫升)瓶号 蒸馏水 抗坏血酸 焦儿茶酚 酶液 偏磷酸 备 注 4 2 2 抗坏血酸氧化酶 4 2 2 抗坏血酸氧化酶 4 2 2 1 空白 3 2 1 2 抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶 3 2 1 2 抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶 3 2 1 2 1 空白向各瓶内加水、抗坏血酸。向、号瓶加焦儿茶酚。向、号加偏磷酸。于 20水浴预热 35 分钟后分别测定。向底物中加

14、入酶液 2 毫升，立刻记时，混匀。20保温 3 分钟后立即加入 1毫升偏磷酸（、号不必再加）杀酶。加淀粉溶液 3 滴，用 0.005M 碘液滴定至浅兰色为止。记录各号之滴定值。五、计算以每克鲜样品每分钟氧化抗血酸的毫克数表示酶活力。抗坏血酶氧化酶活力(单位克)=-(+)/20.44nW(32)多酚氧化酶活力(单位/克)=(-(+)/2)-(2-)/20.44nW(32)式中0.44每毫升 0.005M 碘液氧化抗坏血酸毫克数。n酶提取液体积（毫升） 。W鲜样品重量（克） 。由于酶液中同时存在以上两种酶，所以测定多酚氧化酶的反应系统中(、号)的抗 坏 血 酸的 消 耗 量 是 两 种 酶 作 用

15、 的 结 果 。 在 计 算 中 要 减 去 抗 坏 血 酸 氢 化 酶 的 底 物 消 耗 量 。实验三 碱性磷酸酶活性功能基团的化学修饰一、实验目的1. 使学生了解与掌握酶化学修饰的方法；2. 使学生了解酶化学修饰后的性质变化。二、实验原理N-溴代琥珀酰亚胺（NBS ）在一定条件下能比较专一地与蛋白质分子中色氨酸残基侧链基团起反应，从而改变咪唑基的化学性质。若色氨酸残基是酶活力所必需的，经 NBS 修饰后，酶活力完全丧失。并在 278 nm 处的紫外吸收值下降。碱性磷酸酶（ALPase ）酶活性中心含有一个色氨酸残基，是酶活力表现所必需的。在 NBS 修饰过程中，随着 NBS 浓度增大酶活

16、力逐渐下降，最终完全失活。酶的紫外吸收光谱特征发生了明显的变化，278 nm 特征吸收峰随着 NBS 浓度的增大而逐渐下降至消失。三、实验材料1. 仪器恒温水浴锅，722 分光光度计，50 L 微量进样器，秒表，贝克曼 UV-650 分光光度计。2. 试剂（1）0.1 mol/L NaAc-HAc 缓冲液（pH 4.5）： 0.1 mol/L NaAc 48 mL+0.1 mol/L HAc 52 mL。（2）2 mmol/L NBS：准确称取 178 mg NBS 溶于 50 mL pH 4.5、0.1 mol/L NaAc-HAc 中。（3）1 mmol/L NBS。（4）测定碱性磷酸酶活

17、力试剂：（底物溶液的终浓度含 0.05 mol/L Na2CO3-NaHCO3 缓冲液，pH 10.1，2 mmol/L MgCl 2，5 mmol/L pNPP）（5）0.1 mol/L NaOH。（6）0.01 mol/L Tris-HCl（pH 7.5） 。（7）0.1 mol/ Na2CO3-NaHCO3 pH 10.1 缓冲液：分别取 0.1 mol/L Na2CO3 溶液（取 28.6 g Na2CO310H2O 溶于 1000 mL 蒸馏水中） 70 mL 和 0.1 mol/L NaHCO3 溶液（取 8.4 g NaHCO3 溶于1000 mL 蒸馏水中）30 mL 混匀，用

18、酸度计准确调节 pH 10.1。（8）0.5 mol/L 醋酸镁溶液：称取醋酸镁 107.25 g 溶于蒸馏水中，稀释至 1000 mL。（9）0.1 mol/L 醋酸钠溶液：称取醋酸钠 8.2 g 溶于蒸馏水中，稀释至 1000 mL。（10）0.01 mol/L 醋酸镁-0.01 mol/L 醋酸钠溶液：取 0.5 mol/L 醋酸镁 20 mL 及 0.1 mol/L 醋酸钠100 mL，混匀后加蒸馏水稀释至 1000 mL。（11）底物溶液（5 mmol/LpNPP）：按以下比例混匀（7）:（8）:（10）:H 2O=1:0.2:0.5:0.28。（12）20 mmol/L MgCl

19、2：称取 1.904 gMgCl2 溶于 1000 mL 蒸馏水中。3. 材料牡蛎碱性磷酸酶液四、实验步骤1、NBS 对酶的修饰作用取 6 支试管，编号。按表 2-1 方法操作：表 2-1管 号 1 2 3 4 5 6ALPase 酶液/mL 各管加入 1 mL0.1 mol/LNaAc-HAc/mL 4.0 3.75 3.50 3.25 3.0 2.751 mmol/L NBS/mL 0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25NBS 终浓度 /mmol/L 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25按上表顺序加入后，混匀，室温放置 5 min 进行修饰作用。 分别得到 1

20、6 号的不同 NBS 浓度修饰的酶液（其中 1 号为对照） 。然后再测定酶的剩余活力。2、NBS 对酶修饰后剩余活力测定取 19 支试管，编号。0 号为空白对照管，用于仪器调零；16 号为测定管，重复 3 组，作平行实验。按表 2-2 操作：表 2-2管 号 0 1 2 3 4 5 6测活底物 各管 1.9 mL预热 37预热 5 min修饰酶液 对应加入已修饰的酶液 0.1 mL反应时间 精确反应 10 min0.1 mol/L NaOH 各管加入 2 mL空白管补加酶液 0.1 mL OD405相对酶活力/% 100以空白管校正仪器，在 722 分光光度计测定波长 405nm 的 OD 值

21、（OD 405） 。3、数据处理通过 405 nm 的 OD 值（OD 405）计算各管的酶活力，以 1 号管的酶活力为 100%，其他管核算为相对活力。以修饰剂 NBS 浓度为横坐标，各管的剩余酶活力为纵坐标绘制酶活力与NBS的关系图。说明 NBS 对碱性磷酸酶的修饰作用。4、NBS 修饰后酶的紫外特征吸收峰的变化情况在贝克曼 UV-650 型分光光度计自动扫描记录天然酶液（无经 NBS 处理，即 1 号酶）和经不同浓度 NBS 处理的酶液的紫外吸收光谱。波长范围为 230-300 nm（在石英比色杯中，空白对照管为 1 mL TrisHCl 缓冲液代替酶液，其他加入量同 3.1 表） 。解

22、释酶的紫外吸收光谱的变化情况。5、NBS 修饰后酶的紫外差示光谱的变化情况在一对含隔板的石英比色杯中，空白对照管的两室为 1、2 室，样品测定管的两室为 3、4 室。按表 2-3 加样：表 2-3室 号 1 2 3 4ALPase 酶液/mL 0.5 0.5 0.1 mol/L Tris.HCl/mL 0.5 0.50.1 mol/LNaAC-HAc/mL 0.5 0.52 mmol/L NBS/mL 0.5 0.5 上述 3 室的酶也在 NBS 浓度为 1 mmol/L 下处理，在紫外分光光度计自动扫描记录波长范围为230-300nm OD 值。解释酶的紫外差吸收光谱的变化情况。五、作业1.

23、 如何用化学修饰方法研究酶活性中心功能基团的性质？2. 酶的化学修饰实验应注意什么事项？3. 如何判断 NBS 是作用于色氨酸残基的？附：（1）碱性磷酸酶：广泛存在于微生物界。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，碱性磷酸酶起了及其重要的作用。在生物体内碱性磷酸酶与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。碱性磷酸酶的作用最适 pH 碱性区域，一般在 pH 9.010.5 范围内。Mg 2+对该酶的活力有显著的激活作用。（2）碱性磷酸酶酶活力分析：通常是以对-硝基磷酸二钠（pN

24、PP）为底物，在 pH 10.1 的碳酸盐缓冲液（含 2 mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化 pNPP 水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物 pNP 在 405nm 处有最大的吸收峰，可以根据 OD405 的值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为：在 37下，以 5 mmol/L pNPP 为底物，在 pH 10.1 的碳酸盐缓冲液含 2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生 1 mmol/L pNP 的酶量定义为 1 个酶活力单位。酶的比活力定义为每 mg 蛋白所具有的酶活力单位数。实验四 超氧化物歧化酶的制备及活力测定一、前言超氧化物歧化酶（Superoxi

25、de Dismutase 简称 SOD）是一种重要的氧自由基清除剂，属金属酶，它在生物界分布极广，它催化的化学反应是：O2- + O2- + 2H+ H 2O2 + O2由于 SOD 能专一清除生物氧化产生的超氧阴离子（D 2-）而起保护细胞的作用，故引起国内外医药界和生化界的极大关注。在食品工业中，可以作为一种天然的抗氧化剂而广泛应用。通过本实分掌握以猪血为原料制备 SOD 的方法。用 SOD 抑制连苯三酚在空气中自氧化速率的方法测其活性。二、原理SOD 是一种酸性蛋白，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、pH 及某些理化性质表现出异常的稳定性，如离于强度非常低，即使加热到 95，SOD

26、 活性丧失也很少，是迄今发现热稳定性最高的球蛋白之一。利用此性质将猪红血球中其它蛋白质沉淀除去，再用 DEAESephadexA50 进行离子交换层析，因为 DEAESephadex A50 是弱碱性阴离子交换树脂，可吸附 SOD，然后用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有 SOD 活性的洗脱液，浓缩，冻干即可得 SOD 成品。三、材料、仪器和试剂（）材料新鲜猪血。（二）仪器大烧杯 500 毫升及 1000 毫升；电热恒温水浴锅；层析柱 117 厘米；自动部分收集器；离心机；超过滤器；台式离心浓缩干燥器，pH 计，752 型紫外分光光度计。（三）试剂1. 0.9%氯化钠溶液。2. 95%乙醇。3

27、. 氯仿。4. 丙酮。5. 磷酸缓冲液（pH7.6、2.5mM50mM） 。6. 试剂 SOD。7. 45mM 连苯三酚缓冲液。8. pH8.2、50mM TrisHCl 缓冲液。9. 10mM 盐酸。四、操作（一）猪血 SOD 的制备1. 取新鲜猪血，离心（3000 转分，20 分钟）除去黄色血浆，红血球用 0.9%氯化钠清洗二次，接着用两倍量的水搅拌溶血半小时。2. 在溶血后的血液中缓慢加入 0.25 倍体积的 95%乙醇和 0.15 倍体积的氯仿，搅拌 15 分钟，离心除去血红蛋白得到清液。3. 向清液中缓慢加入丙酮出现沉淀，离心后得沉淀。4. 使沉淀溶于水，然后置恒温水浴中于 5565

28、，进行热处理 15 分钟以使杂蛋白变性 沉 淀 ， 离心 去 沉 淀 得 清 液 。 清 液 可 再 加 丙 酮 进 行 第 二 次 沉 淀 ， 离 心 分 离 得 沉 淀 供 层 析 用 。5. 用 DEAESephadexA 50 装好层析柱（117 厘米） ，以沉淀上层析柱，用pH7，2.5mM50mM 的磷酸缓冲液进行梯度洗脱，每 4 毫升收集一管，前 20 管不含 SOD 活性，收集具有 SOD 活性的洗脱液。6 把具有 SOD 活性的洗脱液通过超过滤浓缩(SOD 分子量约为 32000)，然后冷冻干燥，可得淡蓝绿色成品。在各制备环节测定酶的总回收率和比活力。计算后将结果填入下表。测

29、定结果统计表结 果纯化步骤酶活力(单位/毫升)蛋白质浓度(毫克/毫升)总体积（毫升） 比活力(单位/毫克) 酶活力总回收率（ %）除血红蛋白丙酮沉淀（一）热 变 性丙酮沉淀（二）柱 层 析（二）活力测定连苯三酚氧化法1. 连苯三酚自氧化速率的测定取 3 支试管分别标号 0、1、2，加入 3 毫升 50M 的 Tris 一 HCl 缓冲液（内含 1mM/L 乙二胺四乙酸二钠） ，在 25下保温 15 分钟，试管 1 加入预热的 45mM 连苯三酚 10 微升左右，记时，速以 0 号试管溶液做空白对照用 752 或 754 分光光度计在 325nm 处测定 4 分钟内每分钟 OD 值变化为A325

30、连。2. SOD 或粗酶提取液活力的测定在 2 号试管中加入预热酶液 10 微升，摇匀，再加入预热的 45mM 连苯三酚 10 微升，计时，仍以0 号管作对照在 325 处测定 4 分钟内每分钟的 OD 值的变化为 A325 酶。3. 酶活力计算酶活力定义：在 25时，1 毫升反应液中每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达 50%时的酶量为一个活力单位。单位活力（/ml）= （A325 连A325 酶）A325 连50%100反应液总体积酶液稀释倍数加酶体积五、注意事项 严格控制连苯三酚的自氧化率在 0.07OD/min。只有控制连苯三酚最终浓度在 0.070.10 范围内，SOD 对自氧化抑制程度才

31、基本不变，如果连苯三酚浓度大于 0.10mM 不仅自氧化速率线性范围减小，而且要大大降低 SOD 对连苯三酚自氧化的抑制程度。 SOD 对连苯三酚自氧化抑制应控制在 50%左右，这样测得的酶单位才可靠。实验表明，随着SOD 加样量的增加，相应酶液的酶单位数却减少。也就是说，以 SOD 对连苯三酚自氧化抑制 50%为标准，如大于这个数值，则实际测得的数据偏低；反之，若酶量过小，测得的数据偏高。因此要适当调节样液的释稀倍数。 连苯三酚和被测样液的加入量采用微量进样，只有 10 微升左右，故在整个反应系统中这个量可以忽略不计。实验五 过氧化物酶活力的测定一、实验目的掌握过氧化物酶活力的测定方法。二、

32、原理过氧化物酶的活力与果蔬的成熟度间接地成正相关，故常称其为“成熟酶” 。在用加热方法杀灭食品中有害的酶时，也常以过氧化物酶作指标酶，因为该酶耐热。过氧化物酶能将愈创木酚（邻甲氧基苯酚）氧化成红棕色的 4-邻甲氧基苯酚。在 470 毫微米波长处测定消化值，即可求酶活力。三、材料、仪器和试剂1材料苹果或其他果蔬。2仪器容量瓶 100 毫升（1） 。具塞比色管 20 毫升（6） 、10 毫升（7） 。刻度吸管 1 毫升（5） 。分光光度计、秒表、组织捣碎机或研体、恒温水浴。3试剂（1）pH5.0、0.2M 醋酸缓冲液(0.2MNaAC70 毫升，0.2MHAC30.0 毫升)。（2）0.1%愈创木

33、酚 将 0.1 克愈创木酚定溶于 100 毫升水中。（3）0.08%H 2O2 取 30%H2O2 2.67 毫升，稀释到 100 毫升，混匀。再从其中取出 10 毫升，用水定容至 100 毫升。（4）英格盐液 吸取 5%分析纯重铬酸钾（ K2Cr2O7）溶液 12 毫升和 10%分析纯硝酸钴Co(NO 3)2溶液 5 毫升，混匀后加水 7 倍稀释，作成标准液，相当于每 100 毫升含有 4-邻甲氧基苯酚 675 微克。取此液 74.07 毫升，稀释至 100 毫升，配成 500 微克/100 毫升（5 微克毫升）溶液。四、操作1标准曲线的制作取 6 支 10 毫升具塞比色管，分别加入 5 微

34、克毫升的英格盐液 10、8、6、4、2、l、0 毫升，然后稀释到 10 毫升。其浓度分别为每毫升含 5、4、3、2、l 、0.5 和 0 微克 4-邻甲氧基苯酚。用分光光度计在 470 毫微米波长处测定光密度（以 0 作空白）以 4-邻甲氧基苯酚含量（微克毫升）为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制标准曲线。2酶液制备将材料洗净，用滤纸吸干。取样品 1 克，切碎，置研钵中，加少量石英砂，研成匀浆。也可用组织捣碎机处理。小心地将匀浆全部用水移入 100 毫升容量瓶中，定容。混匀后离心，取上清液。3测定在 20 毫升具塞刻度试管中，分别加入 pH5.0 醋酸缓冲液 1 毫升，0.1% 愈创木酚溶液 1

35、毫升和酶液 1 毫升（酶活力强时可稀释后再取 1 毫升） ，摇匀。置于 30水浴中，温度平衡后加入 0.08%H2O2溶液 l 毫升，立即记时，混匀。反应 1 分钟，立即倒入比色杯中测 OD470 值。从标准曲线上求出相应的 4-邻甲氧基苯酚的含量。对照试验用 1 毫升蒸馏水代替 0.08% H2O2。以对照试验调整分光光度计的零点。五、计算每 1 毫克 4-邻甲氧基苯酚相当于 1 愈创木酚单位酶活力。用 G.U克鲜重/小时表示酶活力。酶活力=W60n1000式中：W样品 OD470 在标准曲线上对应的 4-邻甲氧基苯酚量（微克毫升）60换算为 1 小时。1000换算为毫克 4-邻甲氧基苯酚。

36、n鲜样品制成匀浆总稀释倍数。实验六 脂肪酶活性的测定一、目的要求(1) 了解脂肪酶活性测定原理，并掌握测定技术。(2) 通过实验，加深对酶活力和比活性含义的理解。二、原 理脂肪酶催化脂肪水解，生成脂肪酸和甘油。产生的脂肪酸可以用标准碱溶液滴定，从而作定量测定。C17H33COOH 十 NaOHC 17H33COONaH 2O三、试剂和器材测试样品脂肪酶溶液：称取 100mg 酶粉，加水少许调匀成糊状，再加水至 25mL，即成稀释 250 倍的酶液，使用前摇匀。试剂l25%聚乙烯醇橄榄油乳化液称取 3g 聚乙烯醇，加蒸馏水 150mL，加热溶解成 2溶液。向其中加入 50mL 橄榄油，用高速组织

37、捣碎机搅动 34 次，每次 10s，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液。20.025mol/L 磷酸缓冲液甲液：称磷酸二氢钾（KH 2PO4）17.01g，加蒸馏水至 500mL。乙液：称磷酸氢二钠（Na 2HPO412H2O）44.77g，加蒸馏水至 500ml。取甲液 13mL 加乙液 100mL 即成 pH7.5，0.25mol/L 的缓冲液，使用前稀释 10 倍。30.05mol/L 氢氧化钠标准溶液称取分析纯氢氧化钠约 40g，加蒸馏水至 1000mL，用标准邻苯二甲酸氢钾（或用标准草酸）标定后备用。使用前稀释至 0.05mol/L。495%乙醇，酚酞指示剂称取酚酞 1g，溶于 100m

38、l70乙醇中。 器材三角瓶(100mL) ，吸量管，恒温水浴，秒表，碱式滴定管，高速组织捣碎机。 四、操作方法1脂肪酶活性的测定取 100mL 三角瓶 4 个，每瓶加入 5mL0.025molL 磷酸缓冲液和 4mL 聚乙烯醇橄榄油乳化液，置于 40水浴中保温 5min，然后在两个瓶中各加入 lmL 酶液，从加入酶液开始精确计算时间，继续保温 15min，取出后立即加入 95乙醇 15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示剂 3 滴，用 0.05molL氢氧化钠滴定至溶液呈粉红色为止。另外两个瓶子不加酶液，也继续保温 15min 后，立即取出，各加入 15mL95乙醇，然后再加入 lmL 酶液，作为

39、对照。2酶活性和比活性的计算本实验规定，1mL 酶液在 40下作用于聚乙烯醇橄榄油乳化液 15min，最后消耗 lmL0.05molL氢氧化钠，作为 100 个活性单位。因为 lmL0.05molL 氢氧化钠可和 14.14mg 油酸中和，所以也可以说，100 个活性单位的酶量，在上述条件下可以释放出 14.14mg 用油酸表示的脂肪酸。1g 酶粉的活性单位（U）（滴定样品所耗碱的毫升数一对照瓶毫升数）100稀释倍数。例用 lmL 稀释 250 倍的酶液进行实验，两瓶样品滴定的耗碱平均值为 5.6mL，对照的耗碱平均值为 0.6mL。则 1mg 酶粉的活性单位（U）（5.60.6）100250

40、125000（U）经凯氏定氮法测定，所用酶粉的蛋白含量为 95，因此，酶的比活性=125000U950mg131.2Umg （蛋白） 。五、注意事项（1）用不同聚合度的聚乙烯醇，测出的数据不同，故应使用同一聚合度的聚乙烯醇，才能进行比较。贮放的乳化液若上层有油析出，应重新搅动再乳化后，才能使用。（2）磷酸氢二钠以含结晶水的为好，不含结晶水的易吸潮。（3）0.05molLNaOH 不宜多配，以免存放后与空气中的 CO2 作用生成碳酸钠（Na 2CO3）影响浓度。（4）酶浓度以样品和对照之间耗碱差 25mL 为宜。六、思考题1试述酶活性和酶的比活性的定义?2如何理解 lmL0.05molLNaOH 可中和 14.14mg 油酸？