1、实验五 蛋白质及氨基酸的呈色反应,一 实验目的,1、了解构成蛋白质的基本结构单位和主要连接方式。2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。,实验原理(一) 双缩脲反应(Biurea reaction) 所谓双缩脲反应是指在碱性条件下，双缩脲与二价铜离子作用，生成紫红色配合物的反应。当加热至 180左右时，两分子尿素缩合脱去一分子氨，生成双缩脲。在肽和蛋白质分子中具有肽键，其结构与双缩脲类似，也能发生此反应，生成蓝紫色或紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定性或定量测定。应当指出，该反应的干扰因素较多，一些含有一个肽键和一个-CONH、-CS-NH 、
2、-CH 2 -NH 等基团的物质也有双缩脲反应。并且NH 对此反应具有严重的干扰，因为NH 与铜离子可生成深蓝色的铜氨配合物。因此我们可以说蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。此反应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。,(二) 茚三酮反应(Ninhydrin reaction) 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生 CO 、NH 3 和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成之还原型茚三酮与另一个水合茚三
3、酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一种常用的氨基酸定量方法。但也有些物质对茚三酮也呈类似的阳性反应，如-丙氨酸、氨和许多一级胺化合物等。所以定性或定量测定中，应严防干扰物存在。 ,茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。,蓝紫色复合物,（三）黄色反应(Xanthoproteic reaction)
4、含 凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠 . 在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发生上述反应，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、指甲、头发等遇浓硝酸变黄即为这一反应的结果。,(四)坂口反应 (Sakaguchi reaction) 在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下，许多含有胍基的化合物 (如胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等)能与-萘酚发生反应生成红色物质。在20种氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反应。 生成的氨被次溴酸钠氧化生成氮。该反应中过量的次溴酸钠是不利的，因其能进一步缓慢氧化，使产物
5、破裂分解，引起颜色消失。但加入适量尿素可破坏过量的次溴酸钠。酪氨酸、色氨酸和组氨酸也能降低产生颜色的强度。甚至会阻止颜色的生成。 该反应灵敏度达 1：250 000。因此常用于定量测定精氨酸的含量和定性鉴定含有精氨酸的蛋白质。 。,乙醛酸反应 (Adamkiewica-Hopkins- Cole reaction),在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。 色氨酸在浓硫酸中与一些醛类反应也形成有色物质。很多人用含有少量醛杂质的冰醋酸或芳香醛等进行此反应。硝酸根、亚硝酸根、氯酸根及过多的氯离子均能妨碍此反应，
6、有微量硫酸铜或 Fe 离子存在时，可以加强色氨酸的阳性反应。,实验材料,（一）试剂 1、 卵清蛋白溶液 2、10% 氢氧化钠溶液 3、1% 硫酸铜溶液 4、尿素 5、0.5%甘氨酸溶液 6、 0.1%茚三酮水溶液 7、0.1%茚三酮乙醇溶液 8、0.5%苯酚溶液 9、浓硝酸 10、0.3%色氨酸溶液 11、0.3%酪氨酸溶液 12、考马斯亮蓝染液 13、大豆提取液（二）器材 1、试管及试管架 2、水浴锅 3、酒精灯（或电热套） 4、量筒 5、滤纸片 6、滴管,实验操作 （一）双缩脲反应：一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双
7、缩脲。冷却后，加 10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入1%CuSO 溶液1滴，振荡之。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 二、取另一支试管，加 1mL卵清蛋白溶液和10%氢氧化钠溶液2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液两滴，随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。,（二）茚三酮反应：一、取 2支试管分别加入蛋白质溶液和0.5%甘氨酸溶液1mL，再加0.5mL 0.1%茚三酮水溶液混匀，在沸水浴中加热12min，观察颜色由粉色变成紫红色再变蓝。 二、在一小片滤纸上滴上一滴 0.5%的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观察
8、紫红色斑点的出现。,（三）黄色反应：一、取一支试管加 4滴0.5%苯酚溶液，再加浓硝酸2滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入10%氢氧化钠溶液，观察颜色转变为橙色。 二、取一支试管加蛋白质溶液 4滴及浓硝酸2滴，由于强酸的作用，开始蛋白质形成白色沉淀，小火加热，则沉淀变为黄色，冷却之，逐滴加入10%氢氧化钠溶液，颜色由黄色转变成深橙黄色。 三、剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴浓硝酸，观察颜色变化。,(四)坂口反应取 2支试管，分别加入1mL 0.3%精氨酸溶液和蛋白溶液，各加20%氢氧化钠溶液5滴，1%-萘酚酒精溶液2滴，次溴酸钠溶液6滴，摇匀，放置片刻，观察出现的颜色。,乙醛酸反应,向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸 (常含有少量乙醛酸或醛类)约1mL并混匀倾斜试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸(AR)约1mL，使其重迭，且勿使二者混合。静置后，观察在两液界面上出现的红紫色环，于水浴中微热，可加快色环形成。 用20%的白明胶作乙醛酸反应。观察结果。,思考题：,1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此时可对水解程度作出什么结论? 2.能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在? 3.白明胶对乙醛酸反应呈阴性，为什么?,
