1、第二章 核酸（nucleic acid）,2.1 核酸的分类和组成 2.2 核酸的结构 2.3 核酸的性质,Friedrich Miescher (1844-1895),Friedrich Miescher worked at the Physiological Laboratory of the University of Basel and in Tbingen and is most well known for his discovery of the nucleic acids. (DNA Pioneers and Their Legacy by Ulf Lagerkvist, 19
2、98, Yale University Press, ISBN 0-300-07184-1). To read excerpts from this book, click DNA Pioneers .,米歇尔Friedrich Miescher（18441895）米歇尔，瑞士生物学家，生前工作于巴塞尔大学的生理学研究室。以发现核酸而闻名世界。米歇尔小时候有严重的听力障碍，因此在童年时代，尽管他非常聪明，但总是害羞并很内向。他酷爱音乐，与其父亲一样是一个天才歌手，在学校的学习成绩很好。1865年米歇尔成为一名医学生，1868年获医学博士学位。但听力问题是他成为临床医生的障碍。1868年，米歇尔
3、感兴趣研究白细胞。为了得到足够的白细胞，他从医院的外科绷带中洗脱脓液的白细胞，分离细胞核，得到一些粘稠的物质，并经实验证明含有含磷和氮，称为核素。随后的研究证明这一物质具有酸性，故称为核酸。这是米歇尔首次发现了重要的生命物质之一核酸。,在1869年，F. Mischer从细胞核中分离得到一种含磷很高的强酸性物质，即现在被称为核酸的物质。 1939年，E. Knapp等第一次用实验方法证实核酸是生命遗传的基础物质。 1944年 Avery等人通过细菌转化试验证明了DNA是遗传物质。 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1981年
4、 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术,1944年O.T.Avery等人通过实验证明DNA是一个携带遗传信息的分子，几年之后，A.Hershy和M.Chase通过噬菌体感染实验也证实DNA是遗传物质。 A.肺炎球菌的转化实验肺炎病菌有二种，一种是光滑型肺炎双球菌：有荚膜、菌落光滑且有毒。这种菌通常外包有一层黏性发光的多糖荚膜，它是细菌致病性的必要成分，引起肺炎；另一种是粗糙型肺炎双球菌：无荚膜、菌落粗糙且无毒。下图给出了O.T.Avery等人具体的肺炎球菌的转化实验过程。,（a）将光滑型肺炎双球菌注入小鼠体内，使小鼠致死。（b）将粗糙型肺炎
5、双球菌注入小鼠体内，对小鼠无害。（c）将光滑型肺炎双球菌加热杀死后，再注入小鼠体内，对小鼠无害。（d）将加热杀死的光滑型肺炎双球菌与粗糙型肺炎双球菌一起注入小鼠体内，小鼠死掉。 （e）从加热杀死的光滑型肺炎双球菌中提取DNA，并尽可能将混在DNA中的蛋白质除去，然后将DNA与粗糙型肺炎双球菌混合后，再注入小鼠体内，小鼠死掉。,B. 噬菌体感染实验-1952年Hershey和Chase用32P标记噬菌体DNA，使标记的噬菌体感染大肠杆菌，经短期保温后，噬菌体就附着在细菌上。然后用搅拌器（10000转/分）搅拌几分钟，使噬菌体与大肠杆菌分开，再用高速离心机使细菌沉淀，分析沉淀和上清中的放射性。用3
6、5S标记噬菌体的蛋白质外壳，进行同样的验证实验。结果大多数噬菌体的DNA存在于细菌中，而外壳留在上清中。但是被感染的细菌内部出现了奇迹。随着被感染的细菌的培养，有的细菌破裂，释放出很多噬菌体来。这说明用于复制的遗传信息是通过病毒DNA，而不是通过病毒蛋白质导入细菌内的。,32P标记 噬菌体DNA,35S标记 噬菌体外壳,2.1 核酸的分类和组成,2.1.1 核酸的分类,核酸,脱氧核糖核酸（DNA） Deoxyribonucleic Acid,核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid,90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体、叶绿体、质粒等。 DNA分子含有生物物种的所有遗传信
7、息。DNA为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。,脱氧核糖核酸（DNA）,核糖核酸（RNA）,分布于胞核、胞液。 RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。 RNA为单链分子。,RNA的类别,根据RNA的功能（P56）,mRNA（messenger）,tRNA（transfer）,rRNA（ribosomal）,约占总RNA的3-5%，代谢活跃，寿命短。 不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大。 它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地 核糖核蛋白体。,约占总RNA的10-15%。 它在蛋白质生物
8、合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。 已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA，细胞内有50种以上。 tRNA分子的大小很相似，最小的一种RNA分子，链长一般在70-90个核苷酸之间，M25000，沉降常数为4s。,约占全部RNA的80%。单链螺旋，代谢稳定，M最大的RNA（106）。 是核糖核蛋白体的主要组成部分。 rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关。,核酸的水解产物,2.1.2 核酸的化学组成,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),碱 基,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(
9、uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,戊 糖,核苷,核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。在大多数情况下，核苷是由核糖或脱氧核糖的C1 -羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合，故生成的化学键称为,N糖苷键。,腺苷(A) 脱氧胞苷(dC),1,N9-糖苷键 1,N1-糖苷键,1,1,N9,N1,“稀有核苷”是由“稀有碱基”所生成的核苷。,存在于tRNA中，少量5-核糖尿嘧啶。是一种碳苷。又称假尿苷 1,C5-糖苷键,1,C5,2.1.3 核苷酸的结构与命名,核苷酸是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成
10、的磷酸酯类化合物，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类。 由于与磷酸基缩合的位置不同而分别生成2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸。最常见者为5-核苷酸（5 常被省略）。,碱基,核苷酸的分子结构,5-核苷酸又可按其在5位缩合的磷酸基的多少，分为一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。,核苷酸的命名及缩写符号,AMP、ADP、ATP； dAMP、dADP、dATP。,2.1.4 核苷酸的衍生物,ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。它的结构如下：,ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),ATP 含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能（30.51KJ/mol）。 AT
11、P 是生物体内最重要的能量转换中间体。用于推动生物体内各种需能的生化反应。 ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,GTP （鸟嘌呤核糖核苷三磷酸）,GTP是生物体内游离存在的另一种重要的核苷酸衍生物。它具有ATP 类似的结构, 也是一种高能化合物。 GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下, ATP 和 GTP 可以相互转换。,环核苷酸的分子结构,环一磷酸腺苷 环一磷酸鸟苷,激素与细胞膜上专一性受体结合经过复杂化学反应促使细胞内的ATP转变为cAMP（第二信使），
12、激素将其所携带的信息传递给cAMP，引起靶细胞的各种生物效应。,含氮激素的作用机制第二信使学说,一分子的核苷酸的3-位羟基与另一分子核苷酸的5-位磷酸基通过脱水可形成3,5-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。,2.2 核酸的结构,2.2.1 核酸的一级结构,多核苷酸链,核酸就是由许多核苷酸单位通过3,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。 核酸具有方向性的长链状化合物，多核苷酸链的两端，一端称为5-端，另一端称为3-端。,多聚核苷酸的特点,在多聚核苷酸中，两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键通常称为3,5-磷酸二酯键。 多聚核苷酸链一端的C5带有一个自由磷酸基，称为5-磷酸端（常
13、用5-P表示）；另一端C3带有自由的羟基，称为3-羟基端（常用3-OH表示）。 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,DNA由dATP、dGTP、dCTP和dTTPDNA的一级结构就是指DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。RNA由ATP，GTP，CTP，UTPRNA的一级结构就是指RNA分子中核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。,1）线条法,核酸一级结构的表示方法,5 pGpCpTpTpAOH 3 5 pGCTTAOH 3 pGCTTAOH GCTTA,2）文字式,核酸一级结构的表示方法,DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它是
14、Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。,2.2.2 DNA的空间结构,A 双螺旋二级结构,A.DNA的X-射线衍射图： (1) 衍射斑点呈交叉状分布 (2) 衍射点之间的距离与层次表明有0.34nm和3.4nm的周期性 (3) 图的顶上和底部是最强的衍射斑点，呈带状,DNA双螺旋结构的研究背景,M. H. F. Wilkins & Rosalind Frankin,Xray photograph of DNA with high quality,1952年,罗莎林德弗兰克林Rosalind Franklin（1920-1958）,罗莎林德弗兰克林Rosalind
15、Franklin（1920-1958）英国物理化学家。1920年生于伦敦，15岁就立志要当科学家。她早年毕业于剑桥大学，专业是物理化学。1945年，获得博士学位之后，她前往法国学习X射线衍射技术。1951年，她回到英国，在伦敦大学国王学院取得了一个职位。此后，弗兰克林加入到了研究DNA结构的行列并加盟到威尔金斯小组。她凭着独特的思维，设计了更能从多方面了解物质不同现象的实验方法，获取了在不同温度下的DNA的X射线衍射图。她把这些各种局部的结构形状汇总，使得DNA的衍射图片越来越全面。1952年5月她终于获得了一张清晰的DNA的X光衍射照片。因此，弗兰克林与威尔金斯提出了DNA的结构可能是双螺旋
16、结构的假设。为Crick和Watson进一步论证DNA的双螺旋结构奠定了基础。,1951年 Franklin和 Wilkins利用X-射线衍射方法分析了DNA的晶体，得到了DNA X-射线衍射图。从衍射图推测出DNA的结构是一个螺旋结构，螺旋沿着螺旋的长轴有两个周期性，第一个周期出现在0.34nm，第二个周期出现在3.4nm。这对于确定DNA的结构是至关重要的线索。,DNA晶体 X-射线衍射图,B. DNA的碱基组成分析：（Chargaff定则） (1) 所有DNA分子中A=T，G=C (2) 同一种生物的所有体细胞DNA的碱基组成相同，与年龄、健康状况、外界环境无关，可作为该物种的特征，用不
17、对称比率 (A+T)/(G+C) 来衡量。 (3) 亲缘越近的生物，其DNA的碱基组成越近，即不对称比率越相近。,DNA双螺旋结构的研究背景,C、DNA的碱基物化数据如碱基的几何大小、键长键角数据、酸碱滴定等。,DNA双螺旋结构的研究背景,DNA双螺旋结构的要点,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35。,（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,DNA双螺旋结构的要
18、点,（3）螺旋横截面的直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺距（即螺旋旋转一圈）高度为3.4 nm。,DNA双螺旋结构的要点,DNA双螺旋结构的要点,（4）双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。 碱基的相互结合具有严格的配对规律，A-T，G-C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A T间形成两个氢键，G C 间 三个氢键。 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,DNA右双螺旋结构模型要点总结 （Watson, Crick, 1953）,1、右双螺旋，反向平行,2、碱基在内，主链在外,3、碱基互补，AT，GC,4、螺旋一
19、圈，十对碱基,5、结构稳定，副键维系,6、大沟小沟，调节关键,DNA双螺旋的稳定性,DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。 维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键和碱基堆积力； 另外，存在于DNA分子中的一些弱键在维持双螺旋结构的稳定性上也起一定的作用。即磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子间形成的离子键及范德华力。 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。,双螺旋结构模型提供了DNA复制的机理，解释了遗传物质自我复制的机制。模型是两条链，而且碱基互补。复制之前，氢键断裂，两条链彼此分开，每条链都作为一个模板复制出一条新的互补链，这样就得到了两对链，解决了一个基本的生物学问
20、题遗传复制中样板的分子基础。,亲本链,子链,子链,在Watson和Crick 的 DNA双螺旋模型公布之后，通过对合成的已知序列的寡核苷酸的X-射线晶体衍射图的研究发现，存在着B型、A型和Z型DNA。B-DNA和A-DNA都是右手双螺旋结构，而Z-DNA是左手双螺旋结构。,B-DNA、A-DNA和Z-DNA双螺旋结构特点,DNA双螺旋存在几种不同类型的构象,B 三级结构,定义： DNA的三级结构指DNA分子（双螺旋）通过扭曲和折叠所形成的特定构象。包括不同二级结构单元间、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。超螺旋是DNA三级结构的一种类型。超螺旋即DNA双螺旋的螺旋。,用两手分
21、别捏住线性DNA分子的两端，捻动其中的一端或两端同时向相反的方向捻动。当向右捻动时（即沿右手螺旋方向捻动），等于紧旋（所谓的“上劲”）。处于这样状态的DNA分子相对于它的松弛状态是一种超过原有旋转状态的状态，所以称为过旋。当将处于松弛状态（B构型）的双螺旋向左捻动时（即沿右手螺旋相反方向捻动），等于解旋（所谓的“ 卸劲”）。处于这样状态的DNA分子相对于它的松弛状态是一种没有达到原有旋转状态的状态，所以称之欠旋。 当将线性过旋或欠旋的双螺旋DNA连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋来抵消过旋或欠旋造成的应力，目的是维持B构象。过旋DNA会自动形成额外左手螺旋，而欠旋形成额外右手螺旋，称为
22、负超螺旋。,向左捻,向右捻,松弛型,正超螺旋,负超螺旋,意义 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,DNA的超螺旋结构,绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。,原核生物DNA的三级结构,在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体。核小体结构属于DNA的三级结构。,真核生物中的核小体结构,DNA的存在形式,组蛋白,DNA的功能,DNA的基本功能是作为遗传信息的载体，为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板。DNA分子中具有特定生
23、物学功能的片段称为基因（gene）。一个生物体的全部DNA序列称为基因组（genome）。基因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1103bp，大肠杆菌为5.7106bp，人为3109bp。,RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。RNA分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。 RNA种类：rRNA、mRNA、tRNA、hnRNA、snRNA、asRNA等。,2.2.3 RNA的空间结构与功能,2.2.3.1 mRNA的结构与功能,mRNA可形成局部双螺旋结构的二级结构。 mRNA在真核生物中的初级产物称为HnRNA。 大多数真核成熟的mRNA分子具
24、有典型的5-端的7-甲基鸟苷三磷酸（m7GTP）帽子结构和3-端的多聚腺苷酸（polyA）尾巴结构。,mRNA一级结构的特点,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构” ，5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为 帽结构 。,真核生物mRNA 5-端帽子结构,大多数真核细胞mRNA在3-末端有一段长约200核苷酸的polyA。polyA是在转录后经polyA聚合酶的作用而添加上去的。 原核生物的mRNA一般无polyA，但某些病毒mRNA也有3-polyA，polyA可能有多方面功能，与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关；与mRNA的半寿期有关
25、，新合成的mRNA, polyA链较长，而衰老的mRNA，polyA链缩短。,帽子结构可保护mRNA免受核酸酶从5端的降解作用，并在翻译起始中具有促进核糖体与mRNA的结合、加速翻译起始速度的作用。多聚A尾可增加mRNA的稳定性和维持其翻译活性。,帽子结构和多聚A尾的功能,mRNA分子中带有遗传密码，其功能是为蛋白质的合成提供模板。mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码（coden）,mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,2.2.3.2 t
26、RNA的结构与功能,tRNA是分子最小，但含有稀有碱基最多的RNA，其稀有碱基的含量可多达20%。tRNA是保守性最强的RNA稳定的三叶草结构。tRNA是单链核酸，但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,tRNA的二级结构 （P57）,tRNA的二级结构由于局部双螺旋的形成而呈现“三叶草”形，故称为“三叶草”结构。tRNA的“三叶草”形结构包括“四环四臂”：氨基酸臂、D臂、反密码子臂、TC臂D环、反密码子环、可变环、 TC环。,tRNA的三叶草型二级结构,1,2,3,叶子,反密码子环,反密码子,载运氨基酸,臂,稀有碱基,(1)氨基酸接受区 包含有
27、tRNA的3-末端和5-末端， 3-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA，A为核苷。氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。 (2)反密码区 与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码,（3）二氢尿嘧啶区 该区含有二氢尿嘧啶。 （4） TC区 该区与二氢尿嘧啶区相对， 假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外，几乎所有tRNA在此环中都含有TC 。 （5）可变区位于反密码区与TC区之间，不同的tRNA该区变化较大。,tRNA的三级结构倒L形,2.2.
28、3.3 rRNA的结构与功能,rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。rRNA与蛋白质一起构成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,在原核生物中，rRNA有三种：5S，16S，23S。其中，16S的rRNA参与构成核蛋白体的小亚基，而5S和23S的rRNA参与构成核蛋白体大亚基。 在真核生物中，rRNA有四种：5S，5.8S，18S，28S。其中，18S的rRNA参与构成核蛋白体小亚基，其余的rRNA参与构成核蛋白体大亚基。,动物细胞核糖体rRNA有四类： 5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA 许多rRNA的一级结构及由一级结构推导 出来的二级结构都
29、已阐明，但是对许多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。,大肠杆菌16S rRNA的二级结构,核酶,具有自身催化作用的RNA称为核酶（ribozyme），核酶通常具有特殊的分子结构，如锤头结构。,2.3 核酸的性质,含氮碱基具有芳香环的结构特点。由于环上极性基团（如羰基、氨基等）的存在，碱基能够发生酮式烯醇式或氨式亚氨式的互变异构。因此，碱基既有芳香环的特性，也具有氨、酮和烯醇等相应的化学性质。,2.3.1 含氮碱基的性质,胺式 亚胺式互变异构,酮式烯醇式互变异构,含氮碱基的碱性,嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性。 环内氨基的pKa值约为9.5。 碱基环外的氨基（存在于A、G和C）的碱性很弱，在生理p
30、H条件下不能被质子化。这种情况与苯胺分子中的氨基相似。 因此嘌呤和嘧啶碱基的碱性主要是环内氨基的贡献。,碱基环氮原子的烷基化反应,在一定条件下，碱基环上的氮原子可以发生烷基化反应。在同样条件下，U和T基本上不起反应。应用CH2N2作为烷基化剂，则所有碱基都能发生上述反应。,与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上
31、质子的解离。DNA没有这种作用。,2.3.2 核酸的两性性质及等电点,2.3.3 核酸的水解,A 酸或碱水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2-或3-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。,B 酶水解,磷酸二酯键 以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）以RNA为底物的RNA水解
32、酶（RNases）。 根据作用方式又分作两类：核酸外切酶核酸内切酶 在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。,2.3.4 核酸的紫外吸收（P61）,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,2.3.5 核酸的变性、复性与杂交,定义：核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。 实质：变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不
33、变。 主要因素：能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,A 核酸的变性,RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。例如:天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260 nm)值增加2540%.而RNA变性后，约增加1.1%。 核酸变性后，260nm的紫外吸收明显增加，这种现象称为增色效应.,热变性和Tm,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度或紫外光吸收值达到最大值的50%的温度称为DNA的解
34、链温度，又称熔融温度（melting temperature）或熔点，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3) 2.44,DNA变性,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘度降低等。,B DNA复性,在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性（
35、又称退火）。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。 DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。 分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。,核酸的杂交,双链DNA,单链DNA,杂交,在DNA复性过程中，双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间，也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间 ，这种现象称为分子杂交。,核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。 在核酸杂交分析过程
36、中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。 利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。,问答题 某DNA样品含腺嘌呤15.1%（按摩尔碱基计），计算其余碱基的百分含量。 DNA和RNA的结构和功能在化学组成、分子结构、细胞内分布和生理功能上的主要区别是什么 DNA双螺旋结构有些什么基本特点？这些特点能解释哪些最重要的生命现象？ 比较tRNA、rRNA和mRNA的结构和功能。 名词解释 DNA的变性和复性 分子杂交 增色效应 基因与基因组 Tm Chargaff定律 碱基配对,
