1、实验十 凝胶过滤层析纯化细胞色素C,一、目的要求,1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯化,二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi,优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N
2、-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶,凝胶及柱的选择,凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡 装柱时要注意操作压。,装柱的两种方法： a.手工操作1/3床体积水加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床打开出水口连续缓慢加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法（如图4-9）,样品上柱 分析用量：柱床体积的12% 制备用量：柱床体积的2030% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰,应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定,三、仪器的使用核酸蛋白检测仪及部分收集器的操作方法,记录仪,1、在仪器使用前，
3、首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。记录仪有两档走纸速度，每小时3厘米和每小时12厘米，可根据记录仪说明书调换不同的走纸速度。 3、将波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100T档。 4、按下ON电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。,5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0“厂家巳调好，光密度A要调零，量
4、程开关拔到100T，调节光量旋钮，使记录仪指针在100mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A“挡，缓慢调节A调零旋钮，使记录仪指示在“0“位，数字显示为“0“。6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。 7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。,注l:记录仪光吸收A读数当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。
5、注2:数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为: A量程选定在0-2.0档时，数显读数2=实际光吸收读数A A量程选定在0-1.0档肘，数显读数1=实际光吸收读数A,部分收集器的操作方法,1将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开“慢“和“定”，再按一下“停“设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次
6、所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。,2定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺“状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺“状态，第一臂试臂为最内的那根。在“逆“状态，第一臂试管为最外的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。,四、操作方法,（一）凝胶的选择与处理 1.凝胶及柱的选择根据细胞色素C的分子量选择Sephadex G100。选用1.5cm60cm的柱子。 2.凝胶的处理凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏
7、水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。,（二）装柱1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。（三）凝胶柱的平衡通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上
8、放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。,（四）加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液5mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入34mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（如图）。（五）洗脱 洗脱时，打开上、下进出
9、口夹子，用0.025mol/LTris-HCl，以每管3mL/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。,(六）收集细胞色素C 收集带有红色的洗脱液，即为经凝胶过滤柱层析纯化的细胞色素C。,五、注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，如随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压、正常。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离无法进行，不得不重新装柱。,六、思考题 1.在本实验中要注意哪些重要环节？,
