1、Western Blot,免疫印迹技术,一、原理 二、步骤 1、蛋白质的分离 2、转移 3、免疫学检测,一、原理,蛋白质样品经过SDS-PAGE分离后，通过转移电泳或直接印迹方式原位转移至固相介质上，并保持原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。 SDS-PAGE依据：蛋白质分子量的差异 （1）SDS使蛋白质带有大量负电荷 （2） SDS、巯基乙醇作用下，结构松散，二硫键打开。,1、分离,（1）制胶 1%琼脂糖封底 装配电泳槽 灌注分离胶 灌注浓缩胶 （2）样品处理 （3）电泳,2、转移,3、免疫学检测,封闭过夜一抗37C 1h 洗3次二抗37C 1h 洗3次底物显
2、色5-15分钟ddH2O洗涤,4、结果,Stacking Gel,Separating Gel,interface,_,+,Tris-glycine buffer, PH8.3,Tris-glycine buffer , PH8.3,Sample with loading buffer,Tris-HCl,PH6.8,PH8.8,10%分离胶,ddH2O 5.9ml 30%丙烯酰胺 5.0ml 1.5mM Tris(PH8.8) 3.8ml 10%SDS 0.15ml 10%过硫酸铵 0.15ml TEMED 0.01ml -15ml,5%浓缩胶,ddH2O 3.4ml30%丙烯酰胺 0.83m
3、l1.0mM Tris(PH6.8) 0.63ml10%SDS 0.05ml10%过硫酸铵 0.05mlTEMED 0.01ml -5ml,凝胶,NC膜,转移,试剂原理,SDS, 巯基乙醇(2-ME)- 强还原剂. AP-化学聚合的催化剂. TEMED-加速剂. PAGE-以单体和双体丙烯酰胺为材料,在催化剂和加速剂作用下,聚合联接而形成的三维网状结构物质.,浓缩胶：主要是使样品在进入分离胶前被浓缩成很窄的圆盘状，从而提高分离的分辨程度。分离胶：被浓缩的盘状样品区带进入此胶内，根据各组分的分子量和电荷的不同而被分开。,SDS-PAGE将洗净,干燥玻璃片嵌入塑胶凹槽中.,用经电极缓冲液配制的1%
4、的琼脂糖 溶液将狭缝口封住(既不漏胶,又可作为盐桥).,待琼脂糖凝固后,将玻板连同胶带凹槽安装在电泳模具上, 依次,用力均匀地拎紧螺栓.,配制分离胶, 依次混合各成分,一旦加入TEMED, 马上开始聚合,故应快速旋动混合物.,混匀后, 倒入玻片之间的空隙(注意不要产生气泡). 加至离顶部约3cm处, 用吸管覆加一层蒸馏水.(防止氧气抑制聚合及保持界面水平). 待20-30min后, 可看到出现界面, 表示已凝固.,配制浓缩胶, 离顶部约1cm时,即插入加样梳. 注意避免混入气泡. 约20-30min凝固.,将含有SDS, DTT的样品缓冲液与样品液(健康者血浆1:10) 1:1 混合后, 沸水
5、煮5-10min, 置于冰上(防止复性), 加样20l/孔,最好在所有剩余的孔中加上等体积的1xSDS加样缓冲液.,电泳,下槽(+), 上槽(-), 100v, 4-5h.,转移电泳 凝胶电泳结束前30min, 将PVDF膜先浸泡在甲醇中,再浸泡在转移缓冲液中, 在转移模具上由下至上依次放入: 若干张3mm滤纸, PVDF膜, 凝胶, 滤纸。注意逐层驱除气泡(用玻棒或移液管)。连接电极: 膜(+), 凝胶(-)。接通电源, 20-30v，45min。,免疫学检测,Block: 1%BSA or 5%milk in TBS-T，overnight。Wash: PBS-Tween 3x5min。,Ab Incubation: HRP 标记的羊抗人IgG，效价随实际调整，也可用打点法决定最佳效价。370c，1h。Wash 3次，每次5min。,Develop: 加入底物溶液显色515min, 待出现棕色条带后, 用ddH2O反复洗涤，终止反应。结果：阳性反应呈棕色条带。,
