1、高中生物复习课件,卉原中学 王廷杰,选修三 现代生物科技专题,致同学们,专题一 基因工程,专题二 细胞工程,专题三 胚胎工程,专题四 生物技术的 安全性和伦理问题,专题五 生态工程,第三讲 DNA的粗提取和鉴定,【考纲解读】,研究课题 DNA的粗提取和鉴定,2、如何证明DNA是遗传物质？,3、DNA主要存在部位是哪里？,1、生物的遗传物质是什么？,用一定的物理或化学方法分离具有不同物理、化学性质的生物大分子（蛋白质、核酸等）。,4、提取DNA时，主要的杂质是什么？如何除去？,RNA、蛋白质、脂质等。,利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。,一、
2、基础知识,实验原理,1、DNA的溶解性：,利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。,如何利用DNA的溶解性使DNA与其他杂质分离？,（2）在酒精溶液中的溶解性：,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。,（1）在NaCl溶液中的溶解性：,根据原理找方法,2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶对DNA没有影响。,DNA能耐80高温。,洗涤剂对DNA没有影响。,如何利用DNA对酶、高温、和洗涤剂的耐受性，使DNA与其他杂质分离？,根据原理找方法,二苯胺试剂鉴定,在沸水浴条件下、DNA与二苯胺反
3、应呈现蓝色。,3、DNA的鉴定,二、实验方案设计,（一）实验材料：,（二）方法步骤：,1、获取含DNA的滤液：,2、去除滤液中的杂质：,3、DNA的析出：,4、DNA的鉴定：,（三）结果分析与评价：,（一）实验材料：,2、常用材料： 动物：鸡血；植物：菜花。,1、选材原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。,（从中选取23种实验材料并比较实验结果） 鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。,（二）方法步骤：,1、破碎细胞，获取含DNA的滤液：,（1）动物细胞：破碎较易。例如，
4、在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。,（2）植物细胞：先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜;再充分研磨。,洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。,例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。,答：会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀
5、物;用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,2、去除滤液中的杂质：,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。,方案一讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白
6、质变性，与DNA分离。,3、DNA的析出：,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。,在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入4ml二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有 蓝色 。,4、DNA的鉴定：,方案实例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材
7、料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。,1、实验材料：,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得。, DNA在NaCl溶液中的溶解度，随着NaCl的浓度的变化而改变。当NaCl浓度为0.14molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。, DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。, DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,2、实验原理：,3、材料用具：,鸡血细胞液（5-10ml）； 蒸馏水； 二苯胺试剂。 95%的冷酒精溶液（置于冰
8、箱内冷却24h）；0.1g/ml的柠檬酸纳溶液；2mol/L和0015mol/L的NaCl溶液； 铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒；烧杯；试管；漏斗；试管夹；纱布。,鸡血细胞液的制备：取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的清液，就可以得到鸡血细胞液。）,
9、鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。,注意事项:,4、方法步骤：,向鸡血细胞液中加入蒸馏水，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后过滤，取其滤液。,（1）提取鸡血细胞的细胞核物质,让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破。,加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,用玻璃棒搅拌有什么意义？,用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。,滤去的是什么物质？得到的是什么？,过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合
10、在一起的DNA。,4、方法步骤：,（2）溶解细胞核内的DNA,将2 mol的氯化钠溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14molL）。,（3）析出含DNA的粘稠物,注意事项：将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DN
11、A分子的附着和缠绕。,4、方法步骤：,（4）滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上,向50 mL烧杯内注入2 molL的氯化钠溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。,（5）将DNA的粘稠物再溶解,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。,（6）过滤含有DNA的NaCl溶液,（7）提取含杂质较少的DNA,在上述滤液中加入95的冷酒精溶液50mL（使用冷酒精对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝
12、状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,DNA分子直径只有2 nm，看到的丝状物是多个DNA子聚在一起形成的。,4、方法步骤：,（8）DNA的鉴定,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的 二苯胺试剂。混合均匀 后，将试管置于沸水中 加热5min，待试管冷却 后，观察并且比较两支 试管中溶液颜色的变化。,案例一：DNA的粗提取和鉴定实验,实验原理：,目的要求：,材料用具：,（1）DNA在NaCl溶液中的溶解度，随着
13、NaCl溶液浓度的变化而改变。,提取核物质,方法步骤：,（2）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质可溶于酒精。,（3）DNA + 二苯胺蓝色物质,溶解核内DNA,析出DNA,滤取含杂质的DNA,粗DNA再溶解,滤出DNA,提取较纯DNA,DNA的鉴定,“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,讨论：此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,（1）两次蒸馏水： 第一步细胞吸水胀破。第三步使 DNA黏稠物析出 。,（2）三次过滤： 第一步DNA存在于滤液里。第四步DNA被留在纱布上。 第六步DNA存在于滤液里。,（3）两次析出： 第三步用0.14 molL
14、 的NaCl溶液含杂质多。第七步用95%的冷酒精。,过滤时用纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物，用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，用纱布12层。,（4）六次搅拌： 第一、二、三、五、七步。,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA。,蓝色,沸水浴,实验步骤流程图,鲜鸡血,0.1g/mL柠檬酸钠 搅拌、离心 或低温静置, 20mL蒸馏水搅拌 、过滤, 2mol/LNaCl、搅 拌,蒸馏水搅拌,过滤,含DNA 的粘稠物, 2mol/L NaCl、 搅拌 过滤,滤液 （含DNA）,冷酒精搅 拌,
15、DNA,二苯胺试剂,滤液（弃）,不溶物（弃）,上层清液（弃）,鸡血 细胞液,不溶物（弃）,DNA,滤液（含 DNA）,（二）案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取,1、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24 h,2、提取DNA的具体步骤,取材：称取30 g菜花，去梗取花，切碎,研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min,过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速，离心25 min，取上清液放入烧杯中)。在4 冰箱中放置几分钟后，再取上清液,沉淀：将一倍体
16、积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀35 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上,（三）结果分析与评价：,观察提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。,1、是否提取出了DNA,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同
17、方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好,2、提取的DNA中杂质分析,3、不同实验方法比较,4、DNA的鉴定方法, 二苯胺试剂鉴定DNA,紫外灯照射法,A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（EB）,B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色,C、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射（暗室中），可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处),甲基绿 （蓝绿色）,在沸水浴条件下、DNA与二苯胺反应呈现蓝色。,全力投入会使你与众不同，你是最优秀的，你一定能做的更好！,请拿出你的课本
18、（54-57页），双色笔和学案，还有你的,你准备好了吗？,激情,1、通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。 2、理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。,【重点和难点】,【学习目标】,第三讲 DNA的粗提取和鉴定,DNA的粗提取和鉴定方法。,一、自主纠错、疯狂记忆（约3分钟）,对照参考答案纠正导学案的错误并理解记忆。,要求：静心、动脑，深入思考。让自己知道哪些懂了，哪些还不懂，不懂的要用红笔画出来，以便讨论时重点突破。,温馨提示,疯狂记忆1、。 2、。 3、。,全力投入会使你与众不同,你是最优秀的。你一定能做的更好！,二、小组合作、讨论解疑（约10分钟）,要求：
19、 1、组长负责协调好分层讨论，先一对一讨论（3-5分钟），然后组内讨论，纠正好答案。要求每个人都有事干，注重讨论的效率。 2、要讨论出自己的东西，讨论完的同学整理总结知识，注意总结本组好的解题方法和规律，准备展示。,讨论内容： 1、自学中不能独立解决的问题。 2、一会儿要展示的问题： （1）【自主预习】 （2）【合作探究】 （3）【课堂检测】,比一比，看一看，哪个小组效率高？,三、踊跃展示、高效点评、大胆质疑：,展示要求： 1、口头展示： 面向同学、语言简洁、准确，声音洪亮； 书面展示： 规范快速，注重总结规律方法。 2、讨论完毕总结整理完善，力争全部过关。 非展示同学：在同学展示的时候继续讨
20、论或记忆总结。并学会倾听，学会整理自己的答案，准备点评补充和质疑。,点评要求： 1、点评时声音洪亮脱稿，注重自己的“教态”。 2、点评讲究方法：先评书写、再评对错、后总结方法规律。 3、点评讲究效率：言简意赅，遇不明白时及时让给其他同学。 非点评同学：注意倾听、思考，关键内容做好笔记，有补充或不明白的地方及时、大胆提出。,踊跃展示（5分钟）、高效点评（15分钟）,（1）【合作探究】,（4）【课堂检测】11、14,（2）【课堂检测】1、6,（5）【课堂检测】15,（3）【课堂检测】7、10,6组,5组,4组,（6）【课堂检测】16,3组,2组,1组,3组,2组,1组,6组,5组,4组,踊跃展示（
21、5分钟）、高效点评（15分钟）,（1）【合作探究】,（4）【课堂检测】11、14,（5）【课堂检测】15、16,（3）【课堂检测】7、10,9组,8组,7组,6组,5组,4组,3组,（6）【课堂检测】,（7）【课堂检测】,（8）【课堂检测】,（9）【课堂检测】,2组,1组,（2）【课堂检测】1、6,3组,参考答案,1、 2次。第一次使鸡血细胞吸水胀破；第二次降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。2、研磨不充分，会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量少，导致看不到丝状沉淀物; 用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,114、C B A C B A A B D B C C D B,15、（1）血细胞大量
22、吸水胀破 加速血细胞破裂DNA、RNA、蛋白质、糖类16、（1）A B （2）将蛋白质和DNA进一步分开（提纯） （3）二苯胺反应 DNA DNA 二苯胺试剂沸水浴加热 冷却后,参考答案,1、（1）食盐 洗涤剂 （2）降低NaCl溶液浓度，使DNA析出 （3）蛋白质 （4）在溶液中加入等体积的95%冷酒精，用玻璃棒搅拌，并将析出DNA丝状物卷起。 （5）加入二苯胺试剂，沸水浴加热，如果出现蓝色，则证明提取到的丝状物为DNA。 2、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 3、方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开； 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。,学科班长总结点评：,学习目标,目标落实 优秀小组 优秀个人,1、通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。 2、理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。,再见！,祝同学们在卉原中学愉快地度过三年的高中生活，考入自己理想的大学！,
