1、实践三 病毒血凝和血凝抑制试验-（以新城疫为例）实践目的：1掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理 2掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。实践内容：1红细胞凝集试验(HA 试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。鸡新城疫病毒的 HA试验现采用微量法，在 V形微量反应板上进行。(1)首先用微量
2、移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25l)。(2)用微量移液器取病毒抗原液 25l加入第 1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取 25l液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第 11孔，第 11孔吸取 25l液体弃掉；病毒稀释倍数依为 1:21:2048，第 12孔为红细胞对照。(3)再以微量移液器每孔加 1.0红细胞悬浮液 1滴(25l)。(4)在振荡器上振荡混匀约 l2 分钟，再置 37作用 15分钟后观察结果。(5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。 表 1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法)孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1
3、1 12病 毒 稀 释 倍 数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l病毒液 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l弃去1 红 细 胞 悬 液 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l感作 置振荡器上混匀 12 分钟，放 37静置 15分钟结 果 例示 # # # # # # # + - - - -#
4、 表示 100完全凝集 + 表示 50凝集 - 表示不凝集结果判定：将反应板倾斜成 45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使 100红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的 HA效价为 1:128，HI 试验时，病毒抗原液 25微升内须含 4个凝集单位，则应将原病毒液作成 128/432 倍的稀释液。2.红细胞凝集抑制试验(HI 试验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。(1)用微量移液器每孔各加入 1
5、滴稀释液(即 25l)，从第 1孔到第 10孔。第 1l孔加稀释液 2滴(50l)。(2)以微量移液器取被检血清 25l，放入第 1孔， ，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取 25l液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第 10孔，最后第十孔吸取 25l液体弃掉；被检血清稀释倍数依为 1:21:1024，第 11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。(3)每孔再加入含有四个单位的病毒液 1滴(25l)至第 10孔，第 1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。(4)置振荡器上振荡 l2 分钟后，放 37静置 20分钟。(5)每孔再加入 1.0红细胞
6、悬浮液 1滴(25l)放振荡器上振荡 l2 分钟混匀，置37，15 分钟后判定结果。表 2 鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法)孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12被检血清稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:1281:2561:5121:1024红 细 胞对 照抗原对照生理盐水 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 50l 25l被检血清 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l弃掉4单 位 病 毒 液 25l 25l 25l 25l 25l 25
7、l 25l 25l 25l 25l 25l振荡器上振荡 12 分钟，放 37作用 20分钟1%红 细 胞 悬 液 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l 25l振荡器上振荡 12 分钟，放 137作用 15分钟结果例示 - - - - - - - + # # - #注： - 表示不凝集 、 + 表示部分凝集、 # 表示完全凝集 。结果判定：将反应板倾斜成 45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能将 4单位病毒
8、物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以 2为底的对数(10g2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为 1：128 或 HI效价为 7(10g2)。结果分析：(1)一般认为鸡的免疫临界水平为 1:8(成年)或 1:16(雏鸡)，随地区不同而稍有差异。(2)鸡血清 HI抗体效价高于 1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI 抗体效价在1:16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。(3)鸡群的 HI抗体水平是以抽检样品的 HI抗体效价(2)的平均值表示的。如果某鸡群的 10份样品中，
9、HI 抗体效价(2)为 8的有 3份样品，为 7的有 5份样品，为 6的有 2份样品，它们的平均值为：837562/3527.1 平均水平在 4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中 HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。(4)大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于 0.1一 0.5，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为 2.0。(5)鸡群接种新城疫疫苗后，经 23 周测血清中的 HI抗体效价，若提高 2个滴度以上，表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若 HI抗体效价无
10、明显提高，表示免疫失败。作业：1每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。2根据血凝价将新城疫病毒稀释成 4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果3回答问题：（1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？（2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？（3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？实践三 病毒血凝和血凝抑制试验-（以新城疫为例）（一）实践目的：1、 掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理2、 掌握鸡新城疫的试验室诊断技术。（二）实践内容与基本要求：实践原理：某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症等，有能凝集动物红细
11、胞的特性，此即红细胞凝集现象。这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，发生红细胞凝集现象。可以利用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在，并可以测定病毒的效价。1、 血凝试验：常多用感染鸡胚液进行，凝集价可达 1:160-1:640也可采用急性病例的组织浸出液，但凝集价较低。本病毒可凝集许多动物的红细胞，但凝集性能不够稳定，故通常作血凝试验时都采用鸡的红细胞采血部位为心脏或翅静脉，取血后加抗凝剂或脱纤维，置于离心机中摇转加生理盐水洗涤三次后，将浓缩的红细胞配成 1%生理盐水悬液，即可应用。 操作方法见实习指导。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，称为该病毒的血凝
12、滴度。2、 血凝抑制试验：单纯地使用血凝试验还不能作出明确的诊断，因为还有其它病原也能引起红细胞凝集，如引起慢性呼吸道病的禽败血支原体。所以需用已知的抗血清作血凝抑制试验，以鉴别病毒。也可用已知病毒来测定病鸡血清中的抗体，而得明确的诊断。但不适于急性病例，通常要在感染后的 5-10天，或出现呼吸症状后的 2天，血清中的抗体到一定水平，就可用试管法。（三）主要器材与药品器材：离心机、试管架、试管、注射器、针头 5-5.5号、感染鸡胚，微量移液器 1套，V型、96 孔板，滴头，微量振荡器，塑料采血管，药品：病毒：鸡新城疫弱毒疫苗；0.85%生理盐水、1%红细胞浑悬液、血清、4 单位病毒。 标准阳性
13、血清；浓缩抗原；0.5%红细胞浑悬液；被检血清；pH7.07.2 磷酸缓冲盐稀释液；pH7.07.2磷酸缓冲盐稀释液：氯化钠（GB126677）170g；磷酸二氢钾（GB127477）13.6g；氢氧化钠（GB62977）3.0g；蒸馏水 1000ml；高压灭菌，4 保存，使用是作 20倍稀释。鸡 1%红细胞悬浮液：由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速置于装有抗凝血剂（3%柠檬酸钠溶液）的离心管中，用生理盐水洗涤 3次，每次以 3000r/min离心 10分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，根据沉淀的红细胞压积，用 PH=7的生理盐水稀释成 1%悬浮液。 被检血清：每群鸡随机采 2030份血样，分离血清
14、。采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至 68cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以 1000r/min离心 5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于 0oC保存。（四）实践方法操作方法4.1 微量血凝试验4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液 50ul，共滴四排。4.1.2 吸取 1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔 50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第 11列孔，再从第 11孔各吸取 50ul弃之。最后一列不加抗原作对照。4.1.3 于每孔加入 0.5%红细胞悬液 50ul。4.1.
15、4 置微型振荡器上振荡 1分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。4.1.5 放室温下（1820oC）3040 分钟，根据血凝图象判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复，以几何平均值表示结果。4.1.6 计算出含 4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。抗原应稀释倍数=血凝滴度/4(B1)上述材料全部按顺序加完后，振荡 96 孔板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于 20-22室温中静置，自第 15 分钟开始观察结果，每 5 分钟检查一次，至 60 分钟结束，观察结果时注意不要摇震 96 孔板。 如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反
16、应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动.（五）结果观察：1首先观察对照孔，红细胞应无凝集。 2观察实验孔+全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐，无红细胞沉积。 + 大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。 + 约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。 +只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆盘周围。 -不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆盘，边缘整齐。病毒血凝呈现的不同程
17、度凝集强度凝集效价：能使红细胞呈+凝集的病毒最高稀释度为凝集效价， 表示含有一个单位血凝抗原。如上述第 7 孔为+，则该病毒悬液效价为 1：128，即 病毒稀释到 1：128 时，每50l 中含一个血凝单位的病毒 。凝集孔数越高,病毒凝集效价越高. 4 单位病毒：血凝试验（HA）测出病毒的 HA 价，配制成 4 单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻备用。病毒的血凝实验（HA）结果分析（五）鸡新城疫微量血凝抑制试验5.2.1 先取稀释液 50ul，加入微量血凝板的第一孔，再取浓度为 4个血凝单位的抗原依次加入 312孔，每孔 50ul，第二孔加浓度为 8个血凝单位的抗原 50ul。5.2.2吸被检血清 5
18、0ul 于第 1孔(血清对照)中,挤压混匀后吸 50ul 于第 2孔,依次倍比稀释至 12孔,最后弃去 50 ul.5.2.3置室温(1820)下作用 20分钟.5.2.4滴加 50ul 0.5%红细胞悬液于各孔中,振荡混合后,室温下静置 3040分钟,判定结果5.2.5每次测定应设已知滴度的 标准阳性血清对照.结果判定1在对照出现正确结果的情况下,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.2若有 10%以上的鸡出现 11(log2)以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.3若监测鸡群的免疫水平,则血凝抑制滴度在 4(log2 )的鸡群保护率为 50%左右;在 4(lo
19、g2)以下的保护率达 90%-100%;在 4(log2)以下的 非免疫鸡群保护率约为 9%,免疫过的鸡群约为 43%.鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示,如平均水平在4(log2 )以上,表示该鸡群为免疫鸡群.（六）实践要点1.配置 1%红细胞悬液时不能用力摇震，以免把红细胞膜震破，造成溶血，影响实验效果。2.在滴加材料时，注意每滴加一种材料更换一个滴头，以免病毒与红细胞混合影响实验效果。3.稀释病毒时将材料充分混匀后再吸出滴入下一孔中。4.适时观察结果，如果长时间放置，凝集的红细胞团会沉降下来，造成观察结果不准确。（七）作业1.报告血凝试验（HA）的血凝效价的判定结果。2.病毒的血凝和血凝集抑制试验试验有何意义?
