1、Elisa 相关试剂的配制 1、抗体或免疫球蛋白稀释液 0.01mol/L pH7.2PBS NaH2PO42H2O 0.39 克；Na2HPO41.27 克； NaCl0.85 克； NaN3200 mg； H2O（蒸馏水） 至 1000ml 2、ELISA 洗液及 HRP 标记抗体稀释液 PH7.4，PBST NaCl2.0 克； KH2PO40.2 克； Na2HPO412H2O 2.9 克； KCl0.2 克； NaN30.2 克； H2O 至 1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml；4C 保存备用 3、包被液（简称 CB）pH9.6 Na2CO31.59 克； NaHCO3
2、2.93 克； NaN30.2 克 ；H2O 至 1000ml 密封盖好，4C 存放备用 4、ELISA 底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液 pH5.0 0.1mol/L 柠檬酸（21.014 克/100ML ）24.3ml ；0.2mol/L Na2 HPO4（28.4 克/L)25.7ml；H2O 50ml；4C 存放备用5、DAB 底物液（不溶性底物，组化病理等） 0.05mol/L pH7.6 tris-HCLTris 6.05 克；HCL(36%) 3.15 克（约 2.7ml 浓 HCL） ； H2O 至 1000ml DAB 为3，3二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色 ELI
3、SA 试剂配制及实验流程是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。以双抗体夹心法举例说明。试剂配制：(1) 包被缓冲液(PH9.6 +0.2 0.05M 碳酸盐缓冲液) ： Na2CO31.59g ;NaHCO3 2.93g ； 加蒸馏水至 1000ml。 （用时稀释成 1x，加 0.1%BSA）(2)洗涤缓冲液(PH7.4 0.15M PBST)：0.05%Tween-20 0.5ml；加在 PBS 缓冲液 1000ml中。PBS 缓冲液： KH2PO4 0.2g ；Na2PO412H2O2.9g ；NaCl8g ；KCl0.2
4、g； 加蒸馏水至 1000ml。(3)封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA)2%2g ；（或 5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。(4）稀释液 ：牛血清白蛋白 0.1 % 0.1g ；加 PBS 缓冲液 100ml。(5） 底物缓冲液（PH5.0 ）：0.2M Na2HPO4(无水 28.4g/L，带 12 结晶水 71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 柠檬酸(无水 19.2g/L，带 1 结晶水 21.01g/L)取 24.3ml；加蒸馏水至100ml。 (或 Na2HPO412H2O1.84g ；柠檬酸H2O 0.51g 加蒸馏水至 100ml) (6)TMB(四甲基联苯胺)显色液（显
5、蓝色）： TMB(2mg/ml 水)0.05ml； 底物缓冲液0.95ml； 30% H2O2 0.001ml ；总体积 1ml。 (7) 或配 OPD(邻苯二胺 )显色液（显黄棕色） （现配避光）：OPD（干粉）0.004g ；底物缓冲液10ml ；30% H2O2 0.015ml ；总体积10ml 。(8)终止液(2M H2SO4)：在 178.3ml 水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约 98%)21.7ml，边加边摇。 操作步骤： 1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为 110g/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4过夜（或 37温育 23 小时） 。次日，弃去孔内溶液，用
6、洗涤液冲洗 3 次，中间振荡。(简称洗涤，下同) 。 2. 封闭：加 0.3ml 封闭液于上述已包被之反应孔中，置 37温育 2 小时。然后洗涤 3 次 3. 加样：加待检样品 0.1ml 于反应孔中，置 37温育 12 小时。然后洗涤。( 同时做空白孔（不加样品） ，阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。 4. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体 0.1ml。置 37 温育 12 小时。然后洗涤。 5. 加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体 0.1ml。37温育 45 分钟1 小时，洗涤5 次。6. 加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的 TMB 底物溶液 0.1ml（或 OPD 显色液
7、） ，37暗处温育 520 分钟，或室温暗处 1040 分钟充分变色。 7. 终止反应：各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。 （TMB 底物蓝色变黄色，OPD 底物黄色变棕色）8.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+” 、 “-”号表示测 OD 值：在 ELISA 检测仪上，TMB 底物法使用 450nm 测各孔 OD 值，OPD 底物法使用 492nm 检测。通常大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。4 间接法操作步骤：1.包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，
8、比例自己定） 4过夜（或 37温育 23 小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗 3 次（5 至 7 次） ，中间振荡。(简称洗涤，下同) 。 2. 封闭：加 0.3ml 封闭液于上述已包被之反应孔中，置 37温育 2 小时。然后洗涤。3. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体 0.1ml。置 37 温育 12 小时。然后洗涤。4. 加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体 0.1ml。37温育 45 分钟1 小时，洗涤 5 次。5. 加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的 TMB 底物溶液 0.1ml（或 OPD 显色液） ，37暗处温育 520 分钟，或室温暗处 1040 分钟充分变色。
9、6.终止反应：各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。 （TMB 底物蓝色变黄色，OPD 底物黄色变棕色）7. 结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+” 、 “-”号表示测 OD 值：在 ELISA 检测仪上，TMB 底物法使用 450nm 测各孔 OD 值，OPD 底物法使用 492nm 检测。通常大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。孕酮1 包被缓冲液，（1）碳酸盐缓冲液（PH9.6 +0.2 0.05M） Na2CO31.59g；NaHCO32.93g；加蒸馏水
10、至 1000ml。（2）tris 缓冲液（0.05mol/L ）50ml 0.1mol/L（Tris）溶液与 x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至 100ml 各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制 所需 pH 值（25） 0.1mol/L HCl 的体积71 45772 44773 43474 42075 40376 38577 36678 34579 32080 2928. 1 26.28.2 22.98.3 19.98.4 17.28.5 14.78.6 12.48.7 10.38.8 8.58.9 7.0某一特定 pH 值的 0.05mol/L Tris 缓冲液的配制：
11、将 50ml 0.1mol/L Tris 碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的 0.1ml/L HCl 混合，加水将体积调至 100ml0.1mol/L 盐酸的配置：买来的浓盐酸是 12 mol/L 的，以配制 1L 0.1mol/L 的盐酸为例：先用量筒量取 8.3 mL 的浓盐酸倒入容量瓶，然后将溶液加蒸馏水稀释至体积为 1 L，此时的溶液就是 0.1mol/L 的盐酸。0.1mol/Ltris 的配置：0.1 mol/L 溶液为 12.114 g/L则 配制 600mlTris 缓冲液的方法：三羟甲基氨基甲烷： 3.6g浓盐酸： 2.09ml3）0.02mol/L 磷酸盐缓冲液(pH
12、7.4)磷酸二氢钾 0.2g ；磷酸氢二钠2.90g；氯化钠 8g；加去离子水定容到1000ml。2 洗涤缓冲液（pH7.4 0.15mol/L） 0.05%Tween-200.5ml；加在 PBS 缓冲液 1000ml 中。PBS 缓冲液：KH2PO4 0.2g；Na2HPO412H2O2.9g；NaCl8.0g；KCl0.2g 加蒸馏水至 1000ml。3 测定缓冲液(Ph7.0 含 0.87NaCl 和 0.1BSA 的 0.1M 磷酸缓冲液)用于标准孕酮，孕酮酶标物及奶样的稀释。 Na2HPO412H2O 21.85g；NaH2PO42H2O6.08g；NaCl8.70g；BSA 1.
13、00g 溶于 1000mL 蒸馏水中4 封闭缓冲液牛血清白蛋白(BSA) 2%2g；（或 5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液 100 ml。0.05mol/L 碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0%BSA2.0gBSA 加配好的 0.05mol/L 碳酸盐缓冲液溶解定量至 100ml5 底物缓冲液（pH5.4）磷酸盐-柠檬酸缓冲液0.2M Na2HPO4(无水 28.4g/L，带 12 结晶水 71.7g/L) 取 25.7ml0.1M 柠檬酸(无水 19.2g/L，带 1 结晶水 21.01g/L) 取 24.3ml加蒸馏水至 100ml。或 柠檬酸（C6H8O7H2O） 0.47g；Na2HPO4
14、12H2O2.00g；6（1） TMB(四甲基联苯胺)显色液（蓝色）A 液(3，3 ，5，5-四甲基联苯胺，TMB): 称取 TMB20mg 溶于 10ml 无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至 100ml。B 液(0.1mol/L 柠檬酸-0.2mol/L 磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4):称取Na2HPO412H2O14.34g，柠檬酸 1.87g 溶于 180ml 双蒸水，加 0.75%过氧化氢尿素1.28ml，定容至 200ml，调 pH 至 5.0-5.4。将 A 液和 B 液按 1：l 混合后即成 TMB-过氧化氢尿素应用液或 TMB(2mg/ml 水) 0.05ml： 底物缓
15、冲液 0.95ml； 30% H2O20.001ml；总体积 1ml。（2）OPD(邻苯二胺)显色液（黄棕色） （现配避光）OPD（干粉）0.004g；底物缓冲液10ml；30%H2O2 0.015ml；总体积 10ml。 （3）TMBS 底物液（用于显色）10mg 四甲基联苯胺硫酸盐（ TMBS）的二甲基亚砜溶液，用底物缓冲液配成 0.2mg/ml 的TMBS 底物液。用前加 H2O2 溶液 30左右。7 终止液 2mol/L H2SO4 用于终止反应在 178.3ml 水中，逐滴加入浓硫酸(18M ，约 98%)21.7ml，边加边摇。 （浓 H2SO4：蒸馏水=1:9）抗原修复液：根据待
16、检测的抗原，选择适当的方法附：抗原修复液（10mM pH6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制（1）储备液的配制：A：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+1000mlB:枸橼酸 21g+蒸馏水 1000ml工作液的配置：A 液 82ml+B 液 18ml+蒸馏水 900ml抗原修复方法：高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM,PH6.0）,淹没切片，盖上高压锅，高压锅内煮沸，上汽 3 分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中或高档，5 分钟；取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中或高档，5 分钟（最佳温
17、度 9295）抗原修复注意事项：组织不能干，选择抗原修复方法要因抗体而异。该方法主要用于 10%福尔马林固定，石蜡包埋组织。抗原修复后至 DAB 显色的过程中，均要用 PBS 缓冲液。DAB 的配制：储备液（DAB 25mg/ml）的配置：DAB250mg+pbs10ml，待完全溶解后分装成1ml,100ul。50ul，20ul，等20冻存。工作液：DAB 储存液 20ul+PBS1000ul+3%H2O2 5ul;20.01mol/L 柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。 30.5mol/L EDTA 缓冲液（ph8.0）：700ml 水中溶
18、解 186.1g EDTA2H2O,用10mmol/L NaOH 调至 ph8.0, 加水至 1000ml. 4. 1mol/L 的 TBS 缓冲液（ph8.0）：在 800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1N 的 HCl 调至pH8.0, 加水 1000ml。 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用 0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用 0.1N 的HCl 配制。 6. 3%甲醇H2O2 溶液：用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制 7. 风裱剂：a.甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合 b 油和 TBS(PBS)配制
19、 8TBS/PBS PH9.09.5,适用于荧光纤维镜标本 ;ph7.0-7.4 适合光学纤维标本 二抗稀释剂: 0.05% 叠氮钠; 0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1 升) 注备: 1) 二抗稀释剂可以储存在 4 C , 6 个月. 2) 不要用含有牛血清白蛋白或其它血清的稀释剂来稀释二抗,因为二抗可能会与牛血清白蛋白或其它血清反应. 3)用 TBS 稀释二抗会降低染色, 因此 TBS 用于有强背景的抗体活碱性磷酸酶标记得二抗,因为磷酸盐可以抑制碱性磷酸酶的活性. 辣根过氧化酶-链霉亲和素(HRP-Streptavidin Dilution Buffer) 稀释剂:
20、0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1 升) 0.05% 硫柳汞 注备:此稀释剂可以储存在 4 C , 6 个月. 碱性磷酸酶-链霉亲和素(AP-Streptavidin Dilution Buffer) 稀释剂:0.05M Tris 缓冲液 (TBS), pH 7.6 ;0.05% 硫柳汞 注备: 1) 此稀释剂可以储存在 4 C , 6 个月. 2) 磷酸缓冲液不能用来稀释碱性磷酸酶-链霉亲和素,因为磷酸盐回抑制碱性磷酸酶活性 . 荧光染料 (Avidin-FITC, Avidin-Texas Red, Avidin-AMCA) 稀释剂: 0.01M 磷酸缓冲液(PBS)
21、 pH7.2 (注: 1 升) 0.05% 硫柳汞荧光封片剂荧光染色封片剂有几种： 1缓冲甘油封片介质(常用) 0.5molL 碳酸盐缓冲液(pH8.5)，lOml；无荧光甘油(AR 级)，90ml,混合后在搅拌器上充分混匀。2聚乙烯醇缓冲甘油混合介质 0.5molL 碳酸盐缓冲液(pH8.5)，40ml；1聚乙烯醇， lOml；分析纯甘油，lOml。三液混合后，不断搅拌 6h，72000g 离心 1h，吸取上清 4保存备用。3荧光信号增强封片剂 聚乙烯醇 40-88，4.8g；分析纯甘油，12ml；蒸馏水，12ml ；0.2mol L Tris盐酸缓冲液(pH85) ，24ml ；l ，4重
22、氮双环2 ，2，2辛烷，L 25g(终浓度约 25)。另外有供应抗荧光衰减封片剂，以高纯度甘油为介质，内含抗荧光淬灭剂，有强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。样品封片后 4oC 或20oC 避光保存 2-3周，可最大限度延长荧光持续时间和维持荧光发光强度，同时封片剂中的其它成分有助于保持组织抗原抗体处于结合状态。适用于所有光谱范围的荧光如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。|荧光封片剂配制：称取 NaHC03 3.7 克，无水 Na2C03
23、 0.6 克溶于 100m1 三蒸水中，然后与甘油 1:1 混合，4保存。 200 微升的甘油和 800 微升的 0.01M 的 PBS 伊红（1）伊红（水溶性）配方：伊红 （水溶性） 2.5-5 g 蒸馏水 500 ml将水溶性伊红溶于蒸馏水中，然后加浓盐酸 10 毫升，充分搅拌，静置过夜后过滤。过滤后的沉淀用蒸馏水冲洗二次，再过滤；将沉淀物连同滤纸一起放入温箱内干燥，加 95%酒精1000 毫升，配成饱和液。使用前再用 95%的酒精 1:1 2 倍稀释，加入 12% 冰醋酸。此方法具有染色时间快，颜色鲜艳，不容易褪色，使用寿命长等特点。 （2）伊红（醇溶性）配方：伊红 （醇溶性） 2.5-
24、5g 75%酒精 1000 ml，加几滴冰醋酸至半透明状TAE 缓冲液TAE 是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE 中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量） ，且双链线状 DNA 在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约 10%，电泳大于 13kb 的片段时用 TAE 缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收 DNA 片段时也易用 TAE 缓冲系统进行电泳。 TAE 的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 50TAE Buffer 配制方法： 1。称量 Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37
25、.2g 于 1L 烧杯中； 2。向烧杯中加入约 800ml 去离子水，充分搅拌均匀； 3。加入 57.1ml 的冰乙酸，充分溶解； 4。用 NaOH 调 pH 至 8.3，加去离子水定容至 1L 后，室温保存。 使用时稀释 50 倍 即 1TAE Buffer（5）TBE 缓冲液 1L名称：TBE（Tris 硼酸） ，是一种 PCR 技术中用到的缓冲液。445 mmol/L Tris 碱54g ;445 mmol/L 硼酸盐27.5g 硼酸； ；10 mmol/L EDTA20 ml 的 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） ；水补足 1LTRIS 是一种最常用的生物缓冲液，常配成 P
26、H 值为 6.8，7.4，8.0，8.8。其 PH值随温度变化很大。一般来说，温度每升高一度，PH 值下降 0.03。 1M TRIS-HCl 6.8 和 1.5M TRIS-HCl 8.8 是 SDS-PAGE 最常用的试剂。 而由 TRIS 配成的 TAE，TBE 等是 DNA 电泳最常用的试剂，TE（PH8.0）主要用于溶解 DNA。TE 为 Tris 加 EDTA 合称。 CAPS现在蛋白质的 PVDF 转膜已经不用 Tris-gly、SDS、20% 甲醇缓冲液:，因为缓冲液中有甘氨酸，所以测序的时候很难区分甘氨酸是 BUFFER 带进去还是蛋白质本身的。现在测序用的转膜缓冲液是：10
27、mM/l CAPS,10%的甲醇。CAPS 电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是 020%，一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白质的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。配制 CAPS 电印迹缓冲液。方法如下：10CAPS（100mmol/L）CAPS 22.3g；加去离子水至 900ml；用 2mol/L NaOH（约 20ml）将 pH 值调至 11.0，然后定容至 1L，贮存于 4。CAPS 电印迹缓冲液（含 10%甲醇的 1CAPS）：10CAPS 200ml；甲醇 200ml；去离子水 1600mlstripping1、stripping buffer 含
28、有适量的 SDS，在低 ph 值或适当的温度下，可以使膜上的大多数抗原抗体复合物分开。使用 stripping buffer 可以去除一抗和二抗，然后可以重新利用膜。2、完全可以用同一种抗体再杂交一次。我的经验是同一张膜 stipping3 次就差不多了，而且用同一种一抗，信号强度是一次比一次递减的。strip 的配方有多种，不同的配方， strip 的原理都不太相同。但是目的都只有一个，那就是使膜上的抗原抗体复合物分开。 （洗脱一抗二抗）Stripping Buffer 配方:-mercaptoethanol 342 l；20% SDS 5 ml；1M Tris-Cl pH 6.7 3.12
29、5 ml；加 ddH2O 至 50 ml。方法：将用过的膜浸入 stripping buffer 中，置 50水浴箱中 30min，间断振摇。之后用TTBS 洗 3*5min 就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。CBS(ELISA 抗原包被缓冲液 )包被缓冲液(pH9.6， 0.05M 碳酸盐缓冲液):NaHCO3 1.59 克；NaHCO32.93 克；加蒸馏水至 1000mlTBSTBS 即 Tris 缓冲盐水，是 Tris-HCl 缓冲盐溶液，为等渗盐溶液加 Tris-HCl 缓冲液 ，在做Western Blot 时用到。配制方法如下： 1 mol/L TrisHCl（p
30、H7.5）10ml ；NaCl8.8g ；蒸馏水至 1000ml；TBST (TTBS)TBST 中含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20 这三种物质，是做 WESTERN BLOT 中常用的一种缓冲溶液。Tween 是一种离子表面活性剂，它可加速抗体非特异性结合的分离。Tween20 含量 0.05%。告诉大家一个免调 pH 值的 10TBST 配方，相信可以解决你的问题，同时也能让广大战友省力不少！体积 1000ml 包括：Tris:30.28g；NaCl:87.66g；HCl:17ml；Tween 20:5ml；使用之前稀释 10 倍即可！PBS磷酸盐缓冲液（简称 PBS）的是常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液。它是一种水基盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，以及（在某些配方） 氯化钾和磷酸钾。缓冲液有助于保持恒定的 pH 值。解决方案的渗透压和离子浓度通常与人体 pH 相近（等渗） 。Elisa 洗涤缓冲液 (PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO40.2 克； Na2HPO12H2O2.9 克 ；NaCl 8.0 克；KCl0.2 克 ;Tween-20 0.050.5ml ; 加蒸馏水至 1000ml；
