1、一、做 ELISA 确定抗原最佳包被浓度，做方阵滴定具体怎么做呢？选择好一份已知为阳性和阴性背景的标本，将你的抗原用 1*CB PH=9.6或1*PB PH=7.4进行倍比稀释（8 个条件）后加入 96孔板每孔 100ul。（一般包被浓度 100ng抗原或抗体/孔，最优包被条件需进行试验选择）4 度过夜取出后甩干，加入 20%NBS封闭每孔 200ul。37 度 2h热封，甩去后拍干即可。将你HRP或 AP标记的抗原或二抗用酶标稀释液进行稀释（倍比稀释 4个梯度）即可。棋盘滴定就是板酶交叉,同时带上阳性、阴性通过试验确定最佳 P/N的包被搭配E的试验2抗原和抗体最佳工作浓度的确定 抗原抗体反应
2、要求在最适比例条件下进行，ELISA 反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件。 1）方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液 1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取 A值。选择强阳性参考血清 A值；为 08 左右，阴性参考血清 A值01 的包被抗原稀释度为工作浓度。 方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作
3、浓度 将抗体用包被液稀释为10mgL、lmgL、0.1mgL 三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行 3孔)，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为 1:l 000、l:5000、l:10000 三个浓度，分别加入每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反应，分别读取 A值。以强阳性抗原液 A值在0.8左右，阴性参考 A值0.1 的条件为最适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。 二、ELISA 最适工作浓度的选择及标准化操作1 最适工作浓度的选择 11 间接法测抗体 酶标抗体工作浓度的选择：用 IgG
4、 进行包被，洗涤。将酶标 IgG 用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。加酸终止反应后，读取吸光度(A)。读取 A 值在 10 时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标 IsC 的工作浓度应为 11 600。 棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度：用包被液将抗原由 1：50 开始作比倍稀释后进行包被，洗涤。将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作 1：100 稀释，加样，保温、洗涤。加按工作浓度稀释的酶标 IsC 抗体，保温、洗涤。加底物显色。加酸终止反应后读取 A 值。选择强阳性参考血清的 A 值为 08 左右、阴性参考血清的 A 值小于 01 的包被抗
5、的稀释度作为工作浓度，从中选取最适工作浓度。 12 夹心法测抗原 在夹心 ELISA 法中，可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。 抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为 100、10 和 01 微克毫升，分别在 ELISA 板上进行包被，每一浓度包括 3 个纵行，洗涤。在 1 个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另 1 横行加入弱阳性抗原液，第 3 横行加入阴性对照液，保温、洗涤。将酶标抗体用稀释液稀释成 3 个浓度，例如 1：1 000、1 ：5 000 和1：25000 。分别加入每个包被浓度的 1 个纵行中，保温、洗涤。加底物显色。加酸终止反应后，读取 A值。以强阳性抗
6、原的 A 值在 0 8 左右、阴性参考的 A 值小于 01 的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶抗体的工作浓度，从中选取包被抗体浓度和酶标抗体的稀释度。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再进一步做棋盘滴定。 2 测定方法的标准化 21 加样 ELISA 中除了包被外，一般需进行 96 孔加样。定性测定中有时不强调加样量的准确性。例如规定为加样1 滴，如不具备相当的条件，要尽量使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中，加样量应力求准确，最好采用量程准确的微量移液器。加样时应将液体加在孔底，不要加在孔壁上部，避免出现气泡。 22 保温 在 ELI
7、SA 中，一般在加标本和结合物后，反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各 ELISA 板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。如用保温箱，空湿盒应预先放在其，以平衡温度。 23 洗涤 洗涤在 ELISA 过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯一类物质即避免非特异性吸附，在 ELISA 中最为常用。ELISA 板的洗涤一般可采用以下方法：吸干孑 L 内反应液；将洗涤液注满板孔；放置 2 分钟，略作摇动；吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为 3-4 次，
8、有时甚至需洗 5-6 次。如有专用洗涤机，应设定标准的洗涤步骤，并定期检查洗涤液，保证洗涤质量。 24 比色 阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。在目测法中，待检血清与抗原对照反应孔和待检血清与特异抗原反应孔均呈无色 文章来源：中华养殖网 http:/或极浅色，判为阴性；待检血清与抗原对照反应孔无色或极浅色，而与特异抗原呈橘黄色，判为阳性。如用比色计测定结果，其准确性则决定于 ELISA 板底的平整与透明度和比色计的质量。 三、ELISA 法抗原包被的浓度如何确定？ELISA法进行抗原包被的时候，抗原包被的浓度是如何确定的。看到有些资料中方阵滴定法，稀释抗原和血清，以强阳性抗原液
9、 A值在 0.8左右，阴性参考 A值0.1 的条件为最适条件。为什么选择这个为最适条件？弱阳性血清有什么用处？ 在摸索包被浓度的时候，血清中抗体的含量是固定的吗？需要提前定值吗？急需答案一般我们做的时候抗原抗体两个变量，抗原的浓度是根据你的抗原的纯度来定的，一般纯化的蛋白是2ng，有时候是要抗体的滴度，抗原浓度固定，抗体或者血清就要拉稀释度，这和酶标仪的灵敏性有关.一般 OD 值在 1.0 左右酶标仪比较灵敏，测量的数据比较准确.OD 值如果很深,达到 2 点几就不灵敏了.所以我们一般选 OD 值在 1.0 左右进行分析.OD 1.0-1.5 之间最佳，当然依据酶标仪的性能而定。个人觉得棋盘
10、ELISA 一定要选择 OD1.0 的点是个误区。首先不同型号的灵敏度应该是不一样的；其次 OD 为 1.0 指的是某个抗原抗体浓度条件下的 OD 值，并不代表通过此次棋盘得到的最佳抗原抗体的浓度所做的各种后续 ELISA 实验的值也是 1.0 左右，所以说选择处于酶标仪灵敏度的最佳状况并不一定符合后续的实验。 （不善表达，不知自己描述清楚没有）我自己觉得要根据不同的实验类型（间接，双抗夹心或是竞争等）来选择最佳抗原抗体工作浓度。象竞争 ELISA，做棋盘的目的是包被抗原和一抗的量，试想如果包被抗原太浓，意味着需要竞争抗原浓度也不能小（毕竟是竞争对手不能悬殊太大） ，这就注定了竞争ELISA
11、的检测限不好（因为竞争抗原往往是要检测的东西，所需浓度越大 IC50 也就越大） 。而一抗也不能足量，否则即能与包被抗原反应又能与检测抗原反应，就不能称为竞争ELISA 了。也不能太少，否则整体 OD 读数太低。双抗夹心 ELISA 也是同样的道理，找到包被抗体和酶标抗体的平衡点，即能OD 与本底之间的平衡点。四、elisa 试剂盒Elisa 试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA 检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗体 ELISA
12、 检测。（一） 、ELISA 简介elisa技术流程ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化
13、效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。然而，影响 Elisa 试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。（二）Elisa 试剂盒测定技术的发展临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。（三）基因工程试剂对免疫测定技术
14、发展的影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。HBsAg 试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与 HBsAg 有不同结合
15、位点的鼠复合单位，可测得 HBsAg 变异样品，提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用 Parl Ehrich 学说（PEI ）HBsAg 标准品，对 ad 标准品的灵敏度为 0.05ng/ml 对 ay 标准品灵敏度为 0.025ng/ml（四）测试剂盒检测原理ELISA 检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的 HEV 多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型 HEV 毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框 2 和开放阅读框 3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM 抗体，这些抗体就会与 HEV 的多肽抗原结合，并固定在上
16、面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人 IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的 HEV IgM 抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入 TMB 底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有 HEV IgM 抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm 处测量 O.D.值,按照本 HEV IgM 抗体 elisa 试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于 Cut-Off 值的样品被认为是初试阳性。（五）操作步骤方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹
17、心法1. 包被：用 0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110g/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml，4 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗 3 次，每次 3 分钟。 （简称洗涤，下同） 。2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37 孵育 1小时。然后洗涤。 （同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔） 。3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。 37 孵育 0.51 小时，洗涤。4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml，37 1030 分
18、钟。5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、 “-”号表示。也可测 OD 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm（若以 ABTS 显色，则 410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔 OD 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性。方法二 用于检测未知抗体的间接法1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至 110g/ml，每孔加 0.1ml，4过夜；2.次日洗涤 3 次；3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml 于上述已包
19、被之反应孔中 ,置 37孵育 1小时,洗涤；4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；5.37孵育 30-60 分钟，洗涤；6.最后一遍用 DDW 洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法 ”的 4、5、6 。（六）试剂器材试剂（1） 包被缓冲液（PH9.60.05M 碳酸盐缓冲液）:NaHCO3 1.59 克NaHCO3 2.93 克加蒸馏水至 1000ml（2） 洗涤缓冲液（PH7.4PBS ）：0.15MKH2PO4 0.2 克Na2HPO412H2O 2.9 克NaCl 8.0 克KCl 0.2 克Tween-20 0.05% 0.5ml加蒸
20、馏水至 1000ml（3） 稀释液：牛血清白蛋白（BSA） 0.1 克加洗涤缓冲液至 100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成 510%使用。（4） 终止液（2M H2SO4）：蒸馏水 178.3ml，逐滴加入浓硫酸（ 98%）21.7ml。（5） 底物缓冲液（PH5.0 磷酸枣柠檬酸）:0.2MNa2HPO4（28.4 克/L）25.7ml0.1M 柠檬酸（19.2 克/L） 24.3ml加蒸馏水 50ml。（6） TMB（四甲基联苯胺）使用液:TMB（10mg/5ml 无水乙醇） 0.5ml底物缓冲液（PH5.5） 10ml0.75%H2O2 32l（7） ABTS 使用液:ABTS
21、 0.5mg底物缓冲液（PH5.5） 1ml3%H2O2 2l（8） 抗原、抗体和酶标记抗体。（9） 正常人血清和阳性对照血清。器材（1） 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40 孔或 96 孔，ELISA 检测仪，50l 及 100l加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。（2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。（3） 4冰箱，37 孵育箱。（七）注意事项1.做好对照正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或 BSA 等封闭。2.实验条件的选择在 ELISA 中，进行各项实验条件的选择是很
22、重要的，其中包括:（1） 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求 PH 在 9.09.6 之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用 4 1824 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0 和 10g/m
23、l 等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的 OD 值。选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为 110g/ml。（3） 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接 ELISA 法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份） 。然后再固定其它条件或采取“方阵法” （包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。（4） 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如 OPD 等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如 TMB 和 ABTS
24、是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以 10-30 分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是 H2O2 在临用前加入。（八）试剂盒的清洗试验原理试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的 HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物 A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。自备材料1 蒸馏水。2 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul 、500ul、1
25、000ul。3 振荡器及磁力搅拌器等。安全性1 避免直接接触终止液和底物 A、B 。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。操作注意事项1 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。3 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物 A、B 液时，避免使用带金属部分的加样器。5 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。6 洗涤酶标板时
26、应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。7 底物 A 应挥发，避免长时间打开盖子。底物 B 对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取 OD 值。8 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。9 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。（九）ELISA 的应用ELISA 法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临
27、床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。五、Protocols/Recipes2012-03-29 9:05Protocols/RecipesAbC-Arrays:10x PBS Recipe for 1 liter Dissolve in 800 ml dist
28、illed water:o 80 g NaCl Reanal, No.:2464-1-22-38, Ntrium-klorid, Ph. Eur.5; MW:58.44o 2 g KCl Reanal, No.:18050-1-01-38, Klium-klorid, a.r.; MW: 74.56o 14.24 g Na2HPO4*2H2O Reanal, No.:08973-1-01-38, di-Ntrium-hidrogn-foszft 2-hidrt, a.r.; MW:177,99o 2 g KH2PO4 Reanal, No.:17890-01-38, Klium-dihidro
29、gn-foszft, a.r.; MW:136.09 Adjust volume to 1 liter with H2O Filtrate through an 0.22um filter and divide in 500ml aliquotes Store at room temperature1x PBS Recipe for 1 liter137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8mM Na2HPO4, 1.46mM KH2PO4 Dissolve in 800 ml distilled water:o 8 g NaCl Reanal, No.:2464-1-22-38, Ntr
30、ium-klorid, Ph. Eur.5; MW:58.44o 0.2 g KCl Reanal, No.:18050-1-01-38, Klium-klorid, a.r.; MW: 74.56o 1.424 g Na2HPO4*2H2O Reanal, No.:08973-1-01-38, di-Ntrium-hidrogn-foszft 2-hidrt, a.r.; MW:177,99o 0.2 g KH2PO4 Reanal, No.:17890-01-38, Klium-dihidrogn-foszft, a.r.; MW:136.09 Adjust volume to 1 lit
31、er with H2O Filtrate trough an 0.22um filter or sterilize by autoclave Store at room temperaturePBS-Tween for 1 liter 0.05% Tween 20, PBS Mix on magnetic stirrer:o 0.5ml Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20)o 1 liter PBSPBS-Tween BSA for 300ml 0.05% Tween 20, 5%
32、BSA, 0.05% azide, PBS Mix on magnetic stirrer:o 300ml PBS-Tweeno 15g BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 1.5ml Sodium azide (from 10% NaN3 stock solution) Filtrate through an 0.45um filter Aliquot 50ml/falcon Store at 4CCa2+ Mg2+ stock solution for 5ml 0.25M Ca2+, 0.07M Mg2
33、+ Dissolve in 5 ml Milli Q water:o 0.1838g CaCl2*2H2O Reanal 11024 MSZ 24161-65 Kalcium-klorid, szrtott MW: 147.02 CaCl2*2H2Oo 0.0712g MgCl2*6H2O Reanal No.: 20281-1-01-38 Magnzium-klorid 6-hidrt MW: 203.30 MgCl2*6H2OCa-Mg-VBS (veronal buffered saline) for 25ml (for serum dilution)2.5mM Ca2+, 0.7mM
34、Mg2+, 0.05% Tween 20, 5%BSA, VBS Mix on magnetic stirrer:o 5ml 5x VBSo 250ul Ca2+ Mg2+ stock solution 0.25M Ca2+, 0.07M Mg2+o 1.25g BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 12.5ul Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20) Adjust volume to 25ml w
35、ith Milli Q water Filtrate though an 0.45um filter Aliquot 1ml/eppendorf Store at -20CMg-EGTA-VBS solution for 10ml (dilute serum 5x with it)2.5mM Mg2+, 6.2mM EGTA, 5%BSA, 0.05% Tween 20, VBS Mix on magnetic stirrer:o 2ml 5x VBSo 310ul 0.2M EGTAo 25ul 1M MgCl2 stock solutiono 0.5g BSA Sigma, No.:A30
36、59-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 50ul 10% Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20) Adjust volume to 10ml with Milli Q water Filtrate though an 0.45um filter Aliquot 1ml/eppendorf Store at -20CEDTA-VBS solution for 10ml (dilute serum 5x with it)25mM EDTA,
37、 5%BSA, 0.05% Tween 20, VBS Mix on magnetic stirrer:o 2ml 5x VBSo 500ul 0.5M EDTAo 0.5g BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 50ul 10% Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20) Adjust volume to 10ml with Milli Q water Filtrate though an 0.45u
38、m filter Aliquot 1ml/eppendorf Store at -20C0.2M EGTA stock solution for 10ml Mix on magnetic stirrer:o 8ml Milli Q watero 0.7608g EGTAethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N,N-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E-4378 LOT 111K5411 FW 380,4 Adjust to pH8 with 10N NaOH otherwise it wont disolve (
39、be careful EGTA is an acid) Adjust volume to 10ml with Milli Q water Store at 4C1x Veronal buffer (VBS)145mM NaCl, 1,8mM Na-diethyl-barbiturate (C8H11O3N2Na), 3mM 5,5-diethyl barbiture acid (C8H12N2O3), pH7.3 Dilute 5x Veronal buffer with Milli Q water5x Veronal buffer for 500ml (5xVBS) 727mM NaCl,
40、9.12mM Na-diethyl-barbiturate (C8H11O3N2Na), 15.63mM 5,5-diethyl barbiture acid (C8H12N2O3), pH7.3 Make solution A:o 0.94g Na-diethyl-barbiturate (C8H11O3N2Na)5,5-Diathylbarbitursaure. Na-salz Serva 18797; MW:206.2o 21.25 g NaCl Reanal, No.:2464-1-22-38, Ntrium-klorid, Ph. Eur.5; MW:58.44o 300ml Mil
41、li Q water Make solution B:o 1.44g 5,5- diethyl barbiture acid 5,5-dietil-barbitursav Reanal 04049; MW:184.2o 100ml Milli Q waterBoil it otherwise it wont dissolve, then cool it down Mix solution A and B set pH to 7.3 with app. 50-70l 10N NaOH Fill up until 500ml with Milli Q water, then store it at
42、 +4CELISA:Method Coat ELISA plate with 50ul/well 0.2-10ug/ml protein (purity should be above 3%) in PBS or carbonate buffer for 2h on R/T or O/N in the fridge Wash 3x with PBS-Tween (alternative: following washing incubate in ELISA-blocking buffer for 30min R/T and wash 3x with PBS-Tween) Incubate i
43、n PBS-Tween diluted antibody/protein solution for 1h at 37C (ideally after 5h reach the equibrium) Wash 3x with PBS-Tween Develope with TMBo Add 100ul TMB developing solution to wellsFor 1 ELISA plate mix: 11ml TMB buffer 110ul TMB solution 22ul H2O2 Hydrogen peroxide 30% solution Sigma H-1009o Add
44、100ul 2M H2SO4 to stop the reactiono Detect absorbance at 450nmCarbonate buffer pH 9.5 for 1 liter (for ELISA coat) Disolve in 1 liter Milli Q water:o 1.6g Na2CO3o 2.9g NaHCO3 Adjust to pH 9.5 Store at R/TELISA blocking-buffer for 10ml 0.05% Tween 20, 5%BSA, 0.05% azide, PBS Mix on magnetic stirrer:
45、o 10ml PBS-Tweeno 100mg BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 50ul Sodium azide (from 10% NaN3 stock solution) Store at +4CTMB solution for 1ml 10mg/ml TNB in DMSO Disolve in 1ml DMSO Dimethyl sulfoxide, minimum 99.5% GC Sigma D5879-100ml o 10mg TNP 3,3,5,5-tetramethyl-benzid
46、ine Sigma T-2885 FW240.3 Store at +4CTMB-buffer for 1 liter0.1M Na-acetate, pH 5.5 Disolve in 950ml Milli Q watero 13.6g Na-acetate Ntrium acett, kristlyvizes CH3COONa*3H2O M:136.08 Reanal 14021 Adjust pH to 5.5 with app. 700ul cc. Acetic acid Ecetsav 96% Reanal 0914-1-08-65 M:60.05 Adjust volume to
47、 1 liter with Milli Q water4M H2SO4 for 1 liter Carefully pour 392ml H2SO4 Sulphuric acid 96% H2SO4 Carlo Erba reagents Code no. 410301 (Reanal 17769) FW 98.078 into 608ml Milli Q water (always pour acide into water)2M H2SO4 for 100ml mix 50ml Milli Q water + 50ml 4M H2SO4 solutionELISA 技术及相关问题在我们的论
48、坛中有许多，在此作一总结如下，其中包括了你需要的内容:六、ELISA 的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。一、试剂的制备 ELISA 的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。 （一）固相载体可作 ELISA 中载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在 ELISA 测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。ELISA 载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径 0.6cm 的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于 ELISA 测定的产品也称为 ELISA 板，国际通用的标准板形是 812 的 96 孔式。为便于作少量标本的检测，有制成 8 联或 12 联孔条的，放入座架后，大小与标准 ELISA 板相同。ELISA 板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的 ELISA 检测，包括加样、洗
