1、浙江工业大学药学院生物化学实验论文2013 年 12 月 13 日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1） ，蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液 A；b、接着调 PH 并加热、离心得热提取液 B；c、用乙醇沉淀离心得提取液 C。 （2） ，蔗糖酶的纯化Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液 D。 （3） ，蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的 OD540值，得各提取液的
2、酶活力与回收率。 （4） ，蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的 OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以 B 为样品）：先将样品 B 消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用 HCl 滴定馏出液，计算蛋白质含量。 （6） ，SDS-PAGE 测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂
3、；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase) ，可作用于 21,2 糖苷键,将蔗糖水解为 D2 葡萄糖和 D2 果糖 ，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为 45-50，最适 ph 为 4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1 实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法
4、属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。1.2 试剂与器材1.2.1 试剂啤酒酵母；醋酸钠（AR） ；甲苯（AR） ；4mol/L 醋酸；95%乙醇（ B，可能是因为 C 中蔗糖酶浓度高于 B 或反应时间控制不好；（2） 、蔗糖酶标曲在 01.-0.7 之间呈线性关系，低于 01 或高出 0.7 都要重新做过；.3.5 注意做葡萄糖标准曲线时，加完各种试剂后要充分摇匀。要求测得的 OD值在 0.10.7测定酶活力时，要准确反应 3min，这个反应时间应该精确把握，不要多 1 秒也不要少 1 秒测得在线性范围外的 OD 值，需重新配液
5、显色反应。由于某些原因我们这一组用的是另一组的试剂，所以数据不符合前面的实验；3.6 认识与体会（1） 、还原糖的测定方法有菲林试剂热滴法、3,5-二硝基水杨酸法、nelson试剂法；（2） 、在这种定量且精确地实验中要严格控制一些因素，比如在这个实验中必须严格控制反应时间；4 蔗糖酶的蛋白质含量测定及比活力计算4.1 实验原理比活力是指单位质量（mg）蛋白质中酶的含量（U ） ，常用来表示酶的纯度。比活力=酶的含量（ U）/ 蛋白质含量（mg）测定蛋白质含量的方法有福林-酚试剂法、微量凯式定氮法、紫外吸收法、考马斯亮法等，本实验采用的是福林-酚试剂法，或称 Lowry 法，蛋白质与Folin
6、-酚 A 试剂（碱性）在碱性条件下形成铜- 蛋白质复合物，然后加入 Folin-酚B（酸性） ，铜- 蛋白质复合物将其还原形成深蓝色钼蓝和钨蓝化合物。因为Folin-酚 B 中的磷钼酸 -磷钨酸可被蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸还原生成蓝色化合物。蛋白质浓度增高，产物颜色加深，这一蓝色溶液在 750nm 和 660nm有较强的吸光值。故可用比色法测定已知浓度的标准蛋白质溶液的 OD 值，然后据此测出未知样品的蛋白质浓度5。4.2 试剂与器材mg 0.187 0.173 0.213 0.225V 总/ ml 17.1 19.4 9.0 97.8总活力单位数/U 9613.62 6051.64 86
7、18.40 1100.25回收率/% 100 62.95 89.65 11.444.2.1 试剂试剂 A（碱性铜试剂） 取 Na2CO3（AR）10g 和 NaOH（AR）2g ，加蒸馏水30ml，微热溶解：另取酒石酸钠 （Na 2C2H3O32H2O，AR）0.1g 和CuSO45H2O（AR）0.05g，再加入 30ml 蒸馏水微热溶解，冷却后将上述两溶液混合，再用水稀释至 100ml，即为试剂 A。该试剂为含 10% Na2CO3， 0.1%酒石酸钠和 0.05%硫酸铜的 0.5mol/L NaOH 溶液。保存于塑料试剂瓶中，24至少可使用 1 个月。溶解于 500 毫升蒸馏水中。 ；试
8、剂 B（酚试剂） 在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠（Na 2WO42H2O）,25 克钼酸钠（Na 2MoO42H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加50 毫升 85%磷酸，100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10小时，回流结束时，加入 150 克硫 酸 锂（Li 2SO4） ，50 毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤） 。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为 1mol/L 左
9、右。标准浓度牛血清白蛋白溶液（200g/ml） 精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9%NaCl 溶液。 ；4.2.2 器材分光光度计（使用直径为 10nm 的比色皿） ；刻度吸管 0.5ml（1） ， 2ml（1） ，5ml（1）;试管 1.5 cm15cm（8） ；具塞试管 10 ml（3） ；恒温水浴箱（55） ；4.3 操作方法1标准曲线的制作表 2-6 标准曲线的配置加样表管号 0 1 2 3 4 5BSA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0水 4.5 4.3 4.1 3.9 3
10、.7 3.5试剂 A 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0静置 10min（立即充分混匀）试剂 B 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3静置 10min（立即充分混匀）试剂 B 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2混匀 55水域 5min,测 A660OD660 0.000 0.2370.216 0.344 0.481 0.623 0.739由于在振荡时，管 1 有洒出，因此做了两次。2.未知蛋白浓度的测定按 A（1：100）、B（1：100）、C（1：20）、D（不稀释）进行稀释，A 稀释液去 0.4ml，B、C、D 稀释液各取 5ml 测定 OD660(所得数
11、据如上表所示)。【注意】Folin-酚 B 试剂在酸性条件下稳定，而 Folin-酚 A 试剂在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当 Folin-酚 B 试剂加入后，应迅速摇匀（加一管，摇一管） ，使还原反应产生在试剂被破坏之前。4.4 结果与分析4.4.1 结果表 2-7 实验结果数据记录表标准牛血清蛋白（ml) 标准牛血清蛋白(g) OD6600.2 40 0.216/0.2370.4 80 0.3440.6 120 0.4810.8 160 0.6231 200 0.739样品 A1 B1 C1 D1OD660 0.390 0.276 0.3470.118（小）牛 血 清
12、蛋 白 标 准 曲 线 图0.2160.3440.4810.6230.739C1,79.96969697,0.347B1,58.45454545,0.276A1, 93, 0.39D1,10.57575758,0.118y = 0.0033x + 0.0831R2 = 0.999100.10.20.30.40.50.60.70.80 50 100 150 200 250蛋 白 质 含 量 / gOD660值图 2-3表 2-8 实验处理结果总汇表总体积/ml 总酶活/u总蛋白/mg比活力/u/mg蛋白回收率/%酶活回收率/%纯化倍数/倍初提取液 A 17.0 9613.62 316.20 30
13、.40 100 100 1.00热提取液 B 18.0 6051.64 210.24 28.78 66.49 62.95 0.95乙醇提取液 C 8.27 8618.40 16.53 521.38 5.23 89.65 17.15柱分离液 D 86.34 1100.25 0.37 3014.36 0.12 11.44 99.164.4.2 分析（1） 、此次方法的优点是操作简单，灵敏度高；缺点是蛋白质浓度和光密度线性关系不够严格，而且不同的蛋白质会因 Tyr 和 Trp 的含量不同，造成显色程度有差异；（2） 、此实验中由于蔗糖酶不断提纯，虽然也不断损失，但比活力还是应该上升的，但这次实验中比
14、活力 AB，是因为上次实验我们组的酶活力没测，这次用的是上次做的那个组的酶活力；（3） 、测 D 的 OD 值时是 0.118，不在线性范围内，但由于 D 试剂不够用，不重做，本来应该将 D 的取样量提高重做；4.5 注意试剂 A 加完后，立即充分混匀，静置 10min。再向各管加 B 后放置10min，再加第二次。 每次加 A、B 后应立即迅速充分混合。4.6 认识与体会（1） 、folin-酚法之所以比双缩尿试剂法灵敏是因为此法显色原理与后者相同，只是加入了第二种试剂-folin-酚 B 试剂，以此增加显色量，从而提高了灵敏度；（2） 、做实验时要谨慎仔细，尽量避免不必要误差，在本实验中，
15、我在振荡试管时有时会将溶液振出，虽然量不多，但由于此法灵敏度高也会造成相当的误差，在振荡方面仍需练习；5 微量凯氏测总蛋白5.1 实验原理凯氏定氮法由 Kieldahl 于 1833 年首创，是一种元素分析方法。根据取样量分类，可以分为常量和微量。而不同蛋白质中含氮量平均 16%，凯式定氮仪测定含氮量，然后乘以蛋白质换算系数 6.25，得到蛋白质含量。N / 16% = N 6.25 = 蛋白质含量实验共需消化、蒸馏、滴定 3 个步骤，其中消化是为了将有机氮转化为无机氮 ，然后在碱性条件下蒸馏，让无机氮转化成氨气出来，用硼酸试剂吸收，最后用盐酸滴定。滴定指示剂在碱性条件下是绿色，当溶液由绿色-
16、灰色-红色时可认为是滴定完全。NH2CH2COOH + H2SO4 2 CO2 + 3 SO2 + H2O + NH3 2 NH3 + H2 SO4 （NH4）2 SO4 （NH4）2 SO4 + Na OH Na 2 SO4 + 2 H2O + 2 NH3 2 NH3 + 4 H3BO3 （NH4）2B4O7 + 5H2O （NH4）2B4 O7 + 2 HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO35.2 试剂与仪器2.5.2.1 试剂蛋白样品：2g 牛血清白蛋白溶于 0.9%NaCl 溶液并稀释至 100ml；浓硫酸；硫酸钾 3 份与硫酸铜 1 份（质量分数）混合研磨成粉末；30%
17、NaOH 溶液:30g 氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至 100ml； 2%硼酸溶液：2 g 溶于蒸馏水，稀释至 100ml； 混合指示剂：01甲基红酒精溶液和 01甲基蓝酒精溶液临时按 2:1 的比例混合。或 01甲基红酒精溶液和 01溴甲酚绿酒精溶液临时按 1:5 的比例混合5.2.2 器材改良式凯氏定氮仪；克氏烧瓶 50ml（2）;移液管；锥形瓶 50ml（3） ；吸球、玻棒、滴管、量筒；5.3 操作方法1消化凯氏瓶内加入 A 0.1ml、B 0.2ml、C 0.25ml 和 2ml 硫酸，半匙催化剂，消化至淡绿色，定容至 50ml。2.洗涤定氮仪实际操作时，观察到随着锥形瓶内水量增多，指示剂
18、变棕红色。第三次洗涤后，指示剂不变色。3蒸馏实际操作时，在加反应液后，反应室内液体变成棕黑色，液体反应剧烈。指示剂有红色变成棕色，最后变成绿色。4滴定用 0.01N HCl 将锥形瓶中的指示剂滴定至淡紫色，记录消耗 HCl 的量。5.4 结果与分析5.4.1 结果表 2-9次数 1 2HCl 消耗量/ml 0.85 0.82HCl 消耗量（同组）/ml 0.75 0.77样品含氮量=(A-B) N=11mg/ml 样品含蛋白质量=1251mg5.4.2 分析（1） 、上次用 folin-酚法测得的提取液 B 的蛋白质是 210.42mg，而此次测得为 1251mg，影响原因可能有：A、foli
19、n-酚法以 Tyr 和 Trp 为中心测，实际蛋白质有其他氨基酸且不一定符合比列；B、凯氏定氮法中不能否定其含有其他含氮物质；C、收集氨气过程中带入了水蒸气对硼酸 PH 影响较大；D、蒸汽洗涤时间不够长也可以大致实验结果偏大；E、最后滴定过程中，滴定操作的标准与否也对实验的结果影响较大；（2） 、本次试验与上次实验测定的结果由较大的出入，其影响结果的主要因素有：1.收集氨气过程中带入了水蒸气对硼酸 PH 影响较大；2. 蒸汽洗涤时间不够长也可以大致实验结果偏大；3.最后滴定过程中，滴定操作的标准与否也对实验的结果影响较大；5.4.3 结论样品含氮量=11mg/ml 样品含蛋白质量=1251mg
20、5.5 注意（1） 、消化时，样品勿粘于烧瓶壁上；（2） 、定氮仪的橡皮管、塞都需处理；（3） 、蒸馏时火不能太猛；5.6 认识与体会：1、常量凯氏定氮法测总蛋白氮时可用强酸，微量凯氏定氮法测总蛋白氮必须用弱酸。2、folin-酚法与凯氏定氮法比较：（1） 、folin-酚法：操作简单，灵敏度高，但操作需严格计时、干扰多；（2） 、凯氏定氮法：费时间，灵敏度比前者低，但干扰少，用于蛋白质的测定准确6 SAS-PAGE 测定蛋白质的相对分子质量6.1 实验原理电泳是指溶液中带点粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象。蛋白质的电泳迁移率主要取决于它在某 PH 下所带的净电荷量、分子大小（
21、即分子量）和形状的差异性。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（Ap）和加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶孔径大小可通过改变 Acr 和 Bis 浓度来调节。浓度越大，孔径越小，颗粒穿过网孔的阻力越大，反之亦然。网孔大小根据所分离物的分子量的大小来选择。本实验选择分离胶浓度 12%。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续的凝胶电泳两类。不连续凝胶电泳有三大效应：（1）浓缩效应：两层凝胶的孔径不同（孔径的不连续性） ；缓冲液与凝胶离子成分和 pH 不同（缓冲系统的不连续性）（2）分子筛效应
22、：颗粒小，圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大，形状不规则的分子阻力较大，移动较慢。（3）电荷效应：大部分蛋白质在 pH8.3 带负电，电荷多迁移快SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂。它可以破坏蛋白质分子之间的非共价键，形成带大量负电荷的蛋白质-SDS 复合物，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然电荷的差异；引起蛋白质分子构象的改变。6.2 试剂与器材6.2.1 试剂30%丙烯酰胺贮液: 称丙烯酰胺（AR）29.2g、甲叉双丙烯酰胺0.8g，先用 80ml 双蒸馏水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸馏水稀释至 100ml，过滤。用棕色瓶中，4保存
23、一个月。10%的 TEMED；10% 过硫酸铵（ AP）：现用现配。 ；分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：取 Tris 9.08g 溶解在 40ml 双蒸水中，用 4mol/L 盐酸调节至 pH8.8，用双蒸水定容至 50mL， 4保存；浓缩胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：取 Tris 6.06g 溶解在 40ml 双蒸水中，用 4mol/L 盐酸调节至 pH6.8，用双蒸水定容至 50mL，4保存；2SDS-样品缓冲液：1ml 浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCl，pH6.8）+4ml10%SDS+1ml 巯基乙醇
24、+2mL 甘油 0.5ml0.1%(质量浓度)溴酚蓝，加双蒸水定容至 10mL，4保存。SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris， 0.25mol/L 甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3 ）: 取 Tris 15.1g 和 94g 甘氨酸溶解在 900ml 双蒸水中，加入 50ml 10%(质量分数)SDS 贮存液，加双蒸水定容至1000mL 则成 5SDS-电极缓冲液。10%SDS：25gSDS 用双蒸水定容至 250mL，室温保存。染色液：0.25g 考马斯亮蓝 G-250，加入 90mL 50%甲醇溶液和 10mL 冰乙酸，用滤纸过滤。6.2.2 器材垂直板型电泳槽；玻璃
25、板; 大培养皿；烧杯；吸量管；滴管6.3 操作方法1分离酸制备装配制胶工具，按表比例配制分离胶，小心加满水，待聚合好后，倾去水，用滤纸片吸干胶面。 2.浓缩胶制备按表配置浓缩胶，迅速混匀，倒在分离胶上层，插上梳子，待聚合好后，拔出梳子，用滤纸片去除齿孔中的气泡。3.加样取 100L 样品与 100L 样品缓冲液混合，沸水浴 3-5min，取 20L各样品加入齿孔中，加一孔 Marker，将电极缓冲液倒入电泳槽。4.电泳调节电流，电泳至溴酚蓝距酸前沿 1.5cm 左右，停止电泳。5.染色和脱色小心取出凝胶，置于平皿中，加染色液中过夜，用脱色液脱色，换两次脱色液，至背景透明。6计算样品相对分子质量
26、。6.4 结果与分析6.4.1 结果表 2-10蛋白质分子迁移距离染料迁移距离/cm 相对迁移率标准蛋白分子量标准蛋白分子量的对数/cm2.94 0.668 14400 4.1583624921.30 0.295 31000 4.4913616941.19 0.270 43000 4.6334684560.72 0.164 66200 4.8208579890.484.40.109 97000 4.988558957标准蛋白质分子迁移数据表图 2-4 电泳标准曲线图 蛋 白 质 分 子 量 对 数 与 迁 移 率 的 标 准 曲 线0.668181818,00.270454545,4.6334
27、684560.295454545,4.4913616940.163636364,4.8208579890.109090909,4.988558957 y = -1.3971x + 5.0396R = 0.920601234560 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8mR相 对 迁 移 率分子量的对数由电泳迁移率图得到蛋白质相对分子质量：组别 分子量的对数 蛋白质分子迁移距离 相对迁移率 蛋白质相对分子质量4.896714773 0.45 0.102272727 78834.22 4.779231364 0.82 0.186363636 60149.41 4.72207
28、7273 1 0.227272727 52732.37 4.658572727 1.2 0.272727273 45558.85 4.547439773 1.55 0.352272727 35272.79 4.458533409 1.83 0.415909091 28743.09 A4.280720682 2.39 0.543181818 19086.25 4.944343182 0.3 0.068181818 87971.74 4.737953409 0.95 0.215909091 54695.73 4.706201136 1.05 0.238636364 50839.48 4.56014
29、0682 1.51 0.343181818 36319.57 B4.242617955 2.51 0.570454545 17483.08 4.947518409 0.29 0.065909091 88617.28 4.722077273 1 0.227272727 52732.37 C4.525213182 1.62 0.368181818 33512.99 4.261669318 2.45 0.556818182 18267.09 4.890364318 0.47 0.106818182 77689.86 4.814158864 0.71 0.161363636 65186.68 D4.4
30、83935227 1.75 0.397727273 30474.40 表 2-11实际试验图：图 2-56.4.2 分析(1)、由于 R2=0.9206，距离 1 较远，所以回归不好，不够精确；（2）、电泳所得结果中 A 有 7 种不同分子量，B 有 5 种，C 有 4 种,D 有 3种，说明至在提纯提取液 D 时做的实验不好，没有提纯完全，仍有杂质；（3）、网上查询的蔗糖酶的相对分子质量为 40000 左右，而我们的数据中最为接近的分别是 A：35272079；B:36319.57;C:33512.99;D:30474.40;则蔗糖酶的分子量为 33894.94。6.4.3 结论电泳迁移率图得到蛋白质相对分子质量。如上表所示。6.5 注意N,N-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。凝胶模的装配也起到相当重要的作用。保证玻璃板的干净、干燥。配置分离胶和浓缩胶时，最后加 TEMED。混合后迅速加入玻璃槽中。装好浓缩胶后不可预电泳；电泳时要注意溴酚蓝的电泳距离不可超出分离胶；6.6 认识与体会（1）加样品时要在电泳开始前加，不可过早；（2）在 A、B、C 、D 加热时，要把盖子盖紧，防止它爆开；（3）本实验最好将分离胶与浓缩胶做的更大，电泳更长时间，这样能减小实验误差；参考文献：百度文库，百度搜索
