1、死亡受体 DR5 在急性非淋巴细胞白血病细胞中的表达及其临床意义作者：王一苇 孙秉中 张涛 朱华锋 胡佩珍 张传山 【关键词】 死亡受体 关键词: 死亡受体;脱噬作用;受体，细胞表面 ;白血病，非淋巴细胞，急性;死亡区域 摘 要:目的 探讨死亡受体 DR5 在急性非淋巴细胞白血病（ANLL）细 胞中的表达及其临床意义. 方法 培养 Jurkat，NB4 细胞和抽取 ANLL 患者的骨髓细胞，分离出单个核细胞，用免疫组织化学染色的方法测定 DR5 的阳性表达率，所选病例进行诱导化疗后，研究DR5 的阳性表达率与诱导化疗结果的关系. 结果 DR5 的阳性表达率在 Jurkat 细 胞中为 98%，
2、阳性物质主要分布在胞质及胞膜中; 而在NB4 细 胞中则为 81%.不同 ANLL 患者的 DR5 阳性细胞的百分率存在较大的差异，其中最高达 94%，最低为 45%.ANLL 患者的 DR5 阳性表达率与诱导化疗后骨髓涂片的原始和幼稚细胞比例呈负相关，与诱导化疗后的缓解率呈正相关;DR5 的阳性表达率与 ANLL 分型无明显相关. 结论 该结果对 ANLL 诱导化疗后的疗效判定有一定的参考价值. Keywords:death receptor;apoptosis;receptors，cell sur-face;leukemia，nonlymphocytic，acute;death domai
3、n Abstract:AIM To reveal the expression of death receptor5（DR5）in the cells of acute non-lymphocyte leukemia（ANLL）and its clinical significance.METHODS ANLL cell line Jurkat and NB4cells were cultured.Bone marrow cells of ANLL patients were separated.The expressions of DR5in these cells were observe
4、d by using immunohis-tochemical staining method.Inducing chemotherapy was giv-en to all cases to study the relationship between DR5positivi-ty rate and inducing chemotherapy results.RESULTS DR5positivity rate was98%in Jurkat cells with positive signals mainly located in membrane and cytoplasm，81%in
5、NB4cells，and significantly different in ANLL patients，ranging from94%to45%.DR5positivity rate was negatively corre-lated with ratio of primary cell to infantilism cell，and posi-tively correlated with complete remission rate after inducing chemotherapy，and was not significantly correlated with AN-LL
6、clinical types.CONCLUSION The results might provide clinical significance for assessing the therapeutic effects of in-ducing chemotherapy for ANLL. 0 引言 死亡受体（Death Receptor）结构上属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，是与相应配体结合后可导致死亡受体表达细胞凋亡的一类跨膜受体1 ，包括 Fas，TNFR1，DR3，DR4，DR5 等.DR4 与DR5 共用的配体 TNF 相关的凋亡诱导配体（TRAIL）是新近发现的一类
7、TNF 超家族成员.TRAIL 可以选择性杀伤突变细胞而不杀伤正常细胞，但必须以和 DR 结合的方式发挥其特有的功效2，3 .其中DR5 在正常组织中表达较广泛，如睾丸、卵巢、结肠、小肠，肝、 脑、肺、脾和外周血白细胞等均有表达.近来有研究报道 DR5 在某些肿瘤细胞中有表达，其表达水平可能与瘤细胞对 TRAIL 诱导凋亡的敏感性有关4 ，但在急性白血病中的表达情况尚未见报道.我们就 DR5在急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）细胞系和患者肿瘤细胞中的表达及临床意义进行探讨研究. 1 材料和方法 1.1 材料 白血病细胞株 Jurkat，NB4 由本科实验室提供.白血病原代细胞取自本院血液科 1
8、2（男 5，女 7）例 ANLL 患者骨髓细胞，患者年龄 967（平均 4311）岁;M2 1 例， M3 6 例，M4 1 例，M5 1 例，M6 2 例，M7 1 例，正常对照 5 例.其骨髓细胞按常规制备成单个核细胞.主要试剂:RPMI-1640 培养基购自西安华美生物公司，为美国GIBCO 公司产品;DR5 鼠抗人 mAb 为第四军医大学西京医院免疫学教研室惠赠;免疫组化 SABC Envision 试剂盒购自武汉博士德公司，为丹麦 DAKO 公司产 品. 1.2 方法 1.2.1 ANLL 细胞系和培养条件 ANLL 细胞系 Jurkat，NB4 在含有 100mLL-1 胎牛血清、
9、2mmolL-1 谷氨酰胺的RPMI-1640 培养液中、37，50mLL-1 CO2 、饱和湿度下培养，倒置显微镜下观察细胞形态.4872h 传代 1 次，调整细胞密度为5108 1109 L-1 ，实验选用对数生长期细胞. 1.2.2 骨髓单个核 细胞分离 抽取 ANLL 患者及正常对照人群骨髓 5mL（肝素抗凝），用 5mL RP-MI1640 培养液稀释，加于淋巴细胞分离液中（分离液与分离样品体积比为 11），2000rmin-1 ，离心 20min，收集分离液中界面的 单个核细胞，用 RPMI-1640 洗涤2 次，调整细胞密度为 5108 L-1 ，待用. 1.2.3 免疫组化染色
10、 载玻片处理: 用 20mLL-1 丙酮稀释液浸泡干净玻片 30min，取出干燥 5min，纯丙酮涮洗 23 次，然后置无尘处干燥，封闭保存;制备骨髓单个核细胞涂片: 将分离的单个核细胞 50L 滴到玻片上，铺片，丙酮室温固定 10min，晾干备用;免疫组化检测:切片经常规脱蜡至水，30mLL-1 过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，小牛血清封闭，鼠抗人 DR5mAb（一抗）孵育，4过夜，其余步骤按免疫组化 Envision 试剂盒的说明进行.免疫组化以 PBS 替代一抗为空白对照，抗 5-HT 多抗替代一抗为阴性对照. 1.2.4 结果分析 免疫组化图像输入自动图像分析仪，每张切片按随机数字法选取
11、 6 个视野，计算 DR5 阳性表达细胞数.诱导治疗结果评定:经三尖杉酯碱（26mgm-2 ，57d）、阿糖胞苷（100mg200mgm-2 ，57d）或柔红霉素（3070mgm-2 ，3d）、阿糖胞苷 100200mgm-2 ，7d）方案治疗 2 个疗程后，以患者骨髓像中原始细胞加幼稚细胞的百分比作为诱导治疗结果判定标准，5%为完全缓解，5%30% 为部分缓解，30%为 未缓解（M5 除外）. 统计学方法:数据以 x s 表示，采用第四 军医大 学SPLM 统计程序包进行 单因素方差分析及 t 检验. 2 结果 2.1 DR5 在 Jurkat，NB4 细胞系中的表达 培养的 Jurkat，
12、NB4细胞经 DR5mAb 免疫组化染色，DR5 表达细胞中阳性表达物质呈棕褐色，主要分布在胞膜区，胞核无阳性表达.DR5 阳性表达率在 Ju-rkat 细胞中为 98%，在 NB4 细胞中为 81%. 2.2 DR5 在 ANLL 患者骨髓单个核细胞中的表达 将 DR5 在 12例 ANLL 患者骨髓 单个核细胞中的阳性表达率与诱导治疗结果进行对比分析，结果见 Tab1. 表 1 DR5 在 ANLL 患者骨髓单个核细胞中的表达 略 正常对照组 DR5 的阳性表达率均在 98%以上.实验结果表明:DR5 在初治的 ANLL 患者骨髓单个核细胞中的阳性表达率与诱导治疗结果呈正相关（1 例 AN
13、LL-M7 患者因并发感染死亡除外），而与AN-LL 的 FAB 分型无明显相关，即 DR5 的阳性表达水平越强，诱导治疗后完全缓解率越高，化疗效果越好，反之则化疗效果差. 3 讨论 在死亡受体中，Fas 与 Fas 配体（FasL）的 诱导细胞凋亡的机制和作用，已被深入研究5 ，其机制也已得到公认，而 DR5 及其配体TRAIL 的诱导 凋亡过 程以及凋亡信号的传递途径等目前尚不十分清楚.但与 Fas 相同的是，DR5 诱导的细胞凋亡过程也是通过半胱氨酸蛋白酶（caspase）实现的6，7 ;不同的是，DR5 诱导细胞凋亡的过程是 Fas 相关的死亡结构域（FADD）非依赖性的1 .DR5
14、和其配体TRAIL 结合后，细胞质内的凋亡蛋白被启动，从而引 发细胞凋亡.研究显示 TRAIL 易使肿 瘤细胞迅速凋亡，而对正常细胞几乎无毒性作用2，3 ，而且在肿瘤细胞中 DR5 的表达与肿瘤细胞对 TRAIL 所致凋亡的敏感性相关8，9 . 本实验结果显示:Jurkat 细胞中 DR5 为阳性表达，其阳性信号主要分布在胞膜区，阳性表达率高达 98%，而在 NB4 细胞中 DR5 阳性表达率稍低（81%）.在 12 例 ANLL 患者的骨髓细胞中，不同个体的DR5 阳性 细胞的百分率则存在较明显的差异，其中最高达 94%，最低为 45%.正常对照组的 DR5 阳性表达率均在 98%以上.经常
15、规方案诱导化疗两个疗程后，除 1 例因并发症死亡外，DR5 的阳性表达率与化疗后的骨髓中原始和幼稚细胞的百分率呈负相关，与完全缓解率呈正相关.这一结果提示，DR5 在 ANLL 细胞中的表达与肿瘤细胞对TRAIL 所致凋亡的敏感性相关.同时本实验结果还显示，DR5 的阳性表达与 ANLL 的 FAB 分型无明显相关，故本 结果对 ANLL 诱导化疗的预后有一定的参考价值.另外，本研究结果表明，在绝大多数 ANLL细胞中（除 M1 外），均有 DR5 的较高水平的阳性表达.这与以前的研究报道中所指出的细胞增殖活跃往往伴随着凋亡过程的增强是一致的5 . 最近国外的研究表明，应用 NF-B 抑制剂可
16、使耐药的肿瘤细胞对 TRAIL 敏感，而不需增加 DR5 或 DR4 的表达水平 10 .某些致DNA 损伤的化疗药物，如阿霉素、顺铂、地塞米松、盐酸米托恩醌、马法兰等一些化疗药物可上调 DR5 的阳性表达水平，从而增加肿瘤细胞对 TRAIL 所致凋亡的敏感性， 导致 TRAIL 介导的凋亡增加8 .本实验通过对 ANLL 细胞系和 ANLL 患者的细胞中 DR5 的表达情况以及与临床疗效作些初步探讨，旨在为进一步研究 AN-LL 的治疗提供新线索. 参考文献: 1Schulze-Osthoff K，Ferrari D，Los M，Wesselborg S，Peter ME.Apoptosis
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