1、气相色谱Gas chromatography,王晓燕 ,1.光学分析法2.电化学分析法3.色谱分析法4.其他仪器分析法,光学分析法,A:原子光谱B:分子光谱C:X射线光谱D:NMR,顺磁共振,A:原子光谱-原子外层电子跃迁 原子吸收,原子发射,原子荧光B:分子光谱-分子转动,振动,分子中电子能跃迁C:X射线光谱-原子内层电子的跃迁D:NMR,顺磁共振,色谱,色谱的定义：利用不同物质在不同相（流动相，固定相）中的不同分配系数进行分离的方法叫色谱法.,1901年，Tsweet发现色谱分离现象,碳酸钙（固定相）,色素混合液,石油醚 (流动相）,色谱柱,植物色素分离图示,色谱发展的历史,30年代 茨维
2、特分离绿叶色素，产生固液吸附色谱40年代 液液分配色谱法 、TLC、纸色谱50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能60年代 推出了色谱质谱联用技术（GC-MS） 70年代 HPLC出现使色谱分析范围进一步扩大80年代 出现了超临界流体色谱法、毛细管电泳法 90年代 崛起的电色谱法，兼有毛细管电泳法与微 微填充柱色谱法的优点 21世纪 色谱科学将在生命科学等的前沿发挥他不可替代的重要作用,色谱法的分类按物理状态分类根据流动相的物态：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)根据固定相的物态：气-固色谱法、气-液色谱法、液-固色谱法、液-液色谱法按使用的形式分类(1)柱色谱、(2)纸色谱、 (3
3、)薄层色谱按分离机理分类(1)吸附色谱、 (2)分配色谱、 (3)离子交换色谱、 (4)凝胶色谱,色谱法简单分类,色谱法的特点,优点：“三高”、“一快”、“一广”高选择性、高效能 、高灵敏度、分析速度快、应用范围广缺点:对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS),色谱法的应用,色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。色谱质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段,色谱过程和基本原理,一、色谱过程、分离原理及特点
4、二、色谱流出曲线和有关概念三、分配系数与色谱分离,色谱过程指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程分配系数的微小差异吸附能力的微小差异微小差异积累较大差异吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出色谱分离原理色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量,色谱分离特点 1不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等 提供了分离的可能性 2各组分沿柱子扩散分布峰宽 不利于不同组分分离,术语,色谱图,基线,色谱峰的高度、宽度、半峰宽度保留值,保留时间,调整保留时间,死体积,保留体积,调整保留体积,相对保留值,分离度R(分辨率),基本术语,色谱图 各组分的浓度随流出时间而分布
5、的曲线称为色谱曲线，常称为色谱曲线图或色谱图。,基线没有试样进入检测器时，记录仪记录的是一条直线，这条直线称为基线。噪音：使基线发生细小的波动的现象基线是在实验操作条件下， 反映器系统噪声随时间变化的 曲线。,色谱峰的高度、宽度、半峰宽度,峰高(h)：峰高h指色谱峰最高点到基线的距离，一般用cm为单位。峰宽(Y)与半峰宽(Y1/2)从色谱峰两侧的转折点(拐点)作切线，在基线上的截距叫峰底宽(Y)；简称峰宽；峰高一半处色谱峰的宽度叫半峰宽(Y1/2)。由于色谱峰顶呈圆孤形，色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半。,保留值：色谱定性参数,保留值：表示被测组分从进样到色谱柱后出现浓度最大值所需要的时间(
6、或所需载气的体积)，叫做保留值。1.保留时间（tR)：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间2.死时间（t0）：不被固定相溶解或吸附的组分的保留时间。即，分配系数为零的组分。3.调整保留时间（ tR）：组分的保留时间与死时间之差值，即组分在固定相中滞留的时间,死体积（V0 ）：不与固定相作用的组分从进样到柱后出现浓度最大值所需要的载气体积。若载气的体积流速为F0，则死体积为 V0=F0t0保留体积（VR ）：从进样开始到柱后出现浓度最大值所需要的载气体积 VR=F0tR调整保留体积（ VR）：指扣除死体积后的保留体积 VR= t0F0,相对保留值( 1,2 )
7、表示组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比：,值越大，两组分的色谱峰相距越远，分离得越好,色谱峰区域宽度：色谱柱效参数,1.标准差：正态分布色谱曲线两拐点距离的一半对应0.607h处峰宽的一半注：小， 峰窄， 柱效高2.半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽3.峰宽W：正态分布色谱曲线两拐点切线与基线相交的截距,分离度R(分辨率),相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍,衡量色谱分离条件优劣的参数,从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：,(1)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数 (2)根据色谱峰的保留值(或位置),可以进行定性分析 (3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以
8、进行定量分析 (4)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 (5)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据,色谱分析原理,色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。,两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。,三、分配系数与色谱分离,分配系数和容量因子：相平衡参数1.分配系数K(平衡常数
9、)：在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比（色谱过程的相平衡参数） K为热力学常数 与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关 实验条件固定，K仅与组分性质有关 K大的组分，滞留在固定相中的时间长，在柱内移动的速度慢，后流 出柱子。 温度升高，K变小。,分配比k,分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 :,k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。,选择因子,如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的
10、色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好(1. 5) 。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,色谱基础理论,色谱分离是色谱体系热力学过程和动力学过程的综合表现。热力学过程是指与组分在体系中分配系数相关的过程；动力学过程是指组分在该体系两相间扩散和传质的过程。 热力学理论：塔板理论平衡理论 动力学理论：速率理论Vander方程,塔板理论（热力学）,塔板理论假定:塔板和塔板之间不连续；塔板之间无分子扩散；组分在每块塔板的两相间的分配平衡瞬时达到，达到一次分配平衡所需的最小柱长称为理论塔板高度； 一个组分在每块塔板上的分配系数相同；流动相以不连续的形式加入，即
11、以一个一个塔板体积加入。,理论塔板数n越大，理论塔板高度H越小，色谱峰越窄，表明柱效越高；理论塔板高度H与柱长无关。,速率理论（动力学）,H :单位柱长的离散度 ：流动相的平均线速A:涡流扩散项反映由于填充柱中流动相的流动通道有许多，而在不同的通道中，即径向上不同位置的流动相流速不同，样品分子进入不同流速的通道，就会造成整个谱带的展宽B/ :纵向扩散项反应样品谱带在色谱柱轴向上向前后扩散而造成的谱带展宽，载气流速越快，纵向扩散越少C:传质阻力项（流动项传质阻力项、固定相传质阻力项）反映流动相和固定相对样品组分在其中扩散所具有的阻力,气相色谱分离条件的基本关系,1.R与n的关系2.R与k,的关系
12、3.R与保留时间的关系,练习,已知物质A和B的分配系数K分别为6.50和6.31，已知相比(=k/K)为0.422。试计算：（1）两物质的分配比;（2）选择性系数；（3）欲得到分离度为1.5时需多少塔板数？（4）若柱长为806cm，流动相的流速7.10cm/s，则需多长时间可冲洗出各物质？,练习,在3.0m色谱柱上，空气、组分X和组分Y的保留时间分别为1.0、14.0、17.0min，Y的峰宽为1.0min，计算X和Y完全分离时，柱长最短为多少？,根据色谱法的作用机制不同，有多种类型色谱方法，以下列四种为基本类型：,一、分配色谱法二、吸附色谱法三、离子交换色谱法四、空间排阻色谱法,分配色谱法是
13、根据被分离组分在固定相与流动相中的溶解度差别所造成的分配系数差别而被分离。 吸附色谱法是利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸最后混合物得到分离. 离子交换色谱法是依据被测组分与离子交换剂交换能（亲和力）不同而实现分离 空间排阻色谱法利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离,气相色谱(GC),气相色谱法（GC）是英国生物化学家 Martin A.J.P等人在研究液液分配色谱的基础上，于1952年创立的一种极有效的分离方法，它可分析和分离复杂的多组分混合物。参考书:气相色谱方法及应用 刘虎威 化学工业出版社色谱定性与定量 汪正范 化学工业出版社
14、,气相色谱仪,一、气路系统,1. 载气：H2，N2，He，Ar，空气等，载气的选择主要由检测器性质及分离要求决定。载气从气源流出后顺次经过减压阀，净化器，气流调节阀，转子流量计，压力表，气化室，色谱柱和检测器后放空。载气净化2. 气路结构： 单柱单气路：恒温 双柱双气路：程序升温（补偿由于固定液的流失和载气流量不 稳等因素引起的检测器噪声和基线漂移）3. 净化器：提高载气纯度4. 稳压恒流装置。,1.载气是惰性的2.被分析的样品必须要有一定的蒸气压GC不适于相对分子量较大、沸点高、热稳定性差和极性强的物质的分离。3. GC中常用作的载气的气体有N2、H2、He、Ar,二、进样系统,1. 进样装
15、置： 微量注射器、六通阀2. 气化室：瞬间气化，死体积尽可能小，热容量大，无催化反应,色谱定量分析的准确度主要取决于进样的准确度和重现性。,三、分离系统,分离系统是气相色谱仪的“心脏”,由色谱柱组成，它是色谱仪的核心部件，其作用是分离样品。色谱柱主要有两类：填充柱和毛细管柱。,填充柱和毛细管柱的比较,四、温控系统,色谱柱、气化室、检测室三处温度控制气化室温度应使试样瞬间气化但又不分解；检测器除氢火焰外都对温度敏感；柱温的变化影响柱的选择性和柱效，因此柱室的温 度控制要求精确，温控反复根据需要可以恒温，也 可以程序升温。,五、检测系统,把柱后流出的组分信号转变为可测量的信号（一般是电信号）1）热
16、导池检测器（TCD） 通用型检测器：无机、有机都响应2）氢火焰离子化检测器（FID） 仅对含碳有机化合物有响应（永久气体，卤代硅烷，H2O，CO，CO2，NH3，CS2，CCl4不适用）3)电子捕获检测器（ECD） 只对具有电负性的物质有响应4）热离子化检测器：对含N，P有机物有响应5）火焰光度检测器：对含S，P有机物有响应,检测器的性能指标,（一）噪声与漂移 （二）灵敏度（三）检测限 检测限D越小，说明噪音越小，检测器的灵敏度越高，所需的试样量越少。检测器的线性范围：最大检测量与最小检测量之比检测器的线性范围越宽，越能适应不同浓度范围分析的需要，越有利于准确定量。,气液色谱固定相,载体(担体
17、)和固定液组成气液色谱固定相载体的作用:承载固定液的作用,（l）对载体的要求 比表面积大（多涂渍固定液） 无吸附性（不吸附被测组分） 化学惰性（不与固定液发生化学反应） 热稳定性好 一定的机械强度 惰性物质，无吸附性性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应用的有吸水硅胶、纤维素、多孔硅藻土等。,（2）载体类型 大致可分为硅藻土和非硅藻土两类。 非硅藻土载体：有有机玻璃微球载体，氟载体，高分子多孔微球等。这类载体常用于特殊分析，如氟载体用于极性样品和强腐蚀性物质HF、Cl2等分析。但由于表面非浸润性，其柱效低。 硅藻土载体：是目前气相色谱中常用的一种载体，它是由称为硅藻的单细胞海藻骨架组成，主要
18、成分是二氧化硅和少量无机盐，根据制造方法不同，又分为: 红载体和白色载体。,红色载体：是将硅藻土与粘合剂在900煅烧后，破碎过筛而得，因铁生成氧化铁呈红色，故称红色载体，其特点是表面孔穴密集、孔径较小、比表面积较大。对强极性化合物吸附性和催化性较强，如烃类、醇、胺、酸等极性化合物会因吸附而产生严重拖尾。因此它适宜于分析非极性或弱极性物质。白色载体：是将硅藻土与20的碳酸钠（助熔剂）混合煅烧而成，它呈白色、比表面积较小、吸附性和催化性弱，适宜于分析各种极性化合物。国产的101，102系列，英国的Celite系列，英国和美国的Chromosorb系列，美国的GasChrom A， CL， P， Q
19、， S， Z系列等，都属这一类。,对固定液的要求（液体固定相）（1）操作柱温下固定液呈液态（易于形成均匀液膜）（2）操作条件下固定液热稳定性和化学稳定性好（3）固定液的蒸气压要低（柱寿命长，检测本底低）（4）固定液对样品应有较好的溶解度及选择性,组分分子与固定液间的作用力,气液色谱中，混合物的分离取决于组分在气相的分压和活度系数组分与固定液分子间的相互作用：作用力大，后流出；小的，先流出,固定液的特性(极性,选择性),用它可描述和区别固定液的分离特征目前大都采用相对极性和固定液特征常数表示（i）相对极性：1959年由Rohrschneider提出用相对极性P来表示固定液的分离特征。此法规定非极
20、性固定液角鲨烷（异三十烷）的极性为0，强极性固定液，-氧二丙睛的极性为100然后，选择一对物质（如正丁烷一丁二烯），来进行试验。分别测定它们在氧二丙腈、角鲨烷及欲测固定液的色谱柱上的相对保留值，将其取对数后，得到:,相对极性值均在0100之间，每20单位为一级，分为五级。“0”级非极性固定液“+1” 与“+2”级弱极性固定液“+3”级中等极性固定液“+4”与“+5”级强极性固定液,固定液的分类,按固定液的极性和化学类型分类按化学结构分类烃类、硅氧烷类、醇类和醚类、酯类和聚酯、腈和腈醚、有机皂土,固定液的选择,（1）按相似相溶原则选择（2）按组分性质的主要差别选择,固定液的选择a:极性相似的原则
21、固定液与被测组分极性“相似相溶”，K大，选择性好,（i）分离非极性物质：一般选用非极性固定液，这时试样中各组分按沸点次序流出，沸点低的先流出，沸点高的后流出。（ii）分离极性物质：选用极性固定液，试样中各组分按极性次序分离，极性小的先流出,极性大的后流出.,b按化学官能团相似选择：,固定液与被测组分化学官能团相似，作用力强，选择性高 酯类选酯或聚酯固定液 醇类选醇类或聚乙二醇固定液,（2）按组分性质的主要差别选择,组分的沸点差别为主 选非极性固定液 按沸点顺序出柱 沸点低的先出柱组分的极性差别为主 选极性固定液 按极性强弱出柱 极性弱的先出柱,（iii）分离非极性和极性混合物：一般选用极性固定
22、液，这时非极性组分先流出，极性组分后流出。（vi）分离能形成氢键的试样：一般选用极性或氢键型固定液。试样中各组分按与固定液分子间形成氢键能力大小先后流出，不易形成氢键的先流出，最易形成氢键的最后流出。（v）复杂的难分离物质：可选用两种或两种以上混合固定液。,常用的不同厂商毛细管色谱柱牌号对照,气相色谱分析条件的选择,原则：在保证难分离物质对有适当分离度的前提下，使分析时间尽可能短。,影响分离的因素（计算式）,一、载气及其线速的选择,塔板高度H与载气线速度u的关系,载气种类：H2 He N2 Ar实际应用：载气流速稍高于最佳流速。流速高，选择摩尔质量小的载气。流速低，选择摩尔质量大的载气。,二、
23、柱温的选择,最高温度：固定液最高使用温度最低温度：一般必须高于固定液的熔点柱温降低，选择性增加柱温高： K值减少, 不同物质K差值减少柱温低： 柱效能下降,分析时间延长柱温升高，柱效增大宽沸程混合物，选用程序升温法在使最难分离的组分有尽可能好的分离前提下，采取适当低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。,三、柱长和柱径,柱长增加，R增大，但分析时间延长填充柱通常为26m内径增大，增加分离的试样量，但纵向扩散路径增加，柱效降低，填充柱内径一般为36mm,例 1在一根1m长的色谱柱上测得两组分的分离度为0.68,要使它们完全分离以(R=1.5),则柱长应为多少？解根据式：,即在其他操作条件不变
24、的条件下，色谱柱长要选择5m左右才能使分离度达R=1.5,组分达到完全分离。,四、载体的选择,载体粒度减小，柱效将明显提高，但是粒度过细，阻力增加，操作不便，一般载体直径为柱内径的1/201/25之间,五、进样时间和进样量,进样速度必须很快, 1s内完成 进样时间很慢，引起色谱峰扩展变形最大允许进样量应控制在使峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内色谱柱越粗、越长，固定液含量越高，容许进样量越大。 进样量不可过大，否则造成拖尾峰进样量的选择进样量少：检测困难进样量多：色谱峰重叠一般进样量： 液体0.15ul 气体0.110ml,六 汽化温度的选择,针对液体试样，要求试样迅速汽化一般比柱温高30
25、70不宜过高，以免试样被破坏,练习:如何根据具体情况改进分离度？,太小，两组分未分开应改变固定相极性，降低柱温,k 太小，n 也太小，应增大固定液用量，降低柱温,n 太小，许多组分未分开应设法降低板高，提高柱效,例：已知物质A和B在一根30.0cm长的柱上的保留时间分别为16.40和17.63min，不被保留组分通过该柱的时间为1.30min，峰底宽为1.11和1.21min，试计算 （1）柱的分离度 （2）柱的平均塔板数 （3）塔板高度 （4）达1.5分离所需柱长,分析方法及应用,一、定性分析(基于一定操作条件下，各组分的保留时间是一定值的原理)。保留值保留时间、保留体积、保留指数、相对保
26、留指数由于保留时间常受到流动相流速的影响，有时用保留体积而不是保留时间进行定性分析,定量分析,气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的面积或峰高，计算样品中溶质的含量。,峰面积测量方法,峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法。（l）对称形峰面积的测量峰高乘半峰宽法 理论上可以证明，对称峰的面积 A=1065hW12 （2）不对称峰面积的测量一峰高乘平均峰宽法 对于不对称峰的测量如仍用峰高乘半峰宽，误差就较大，因此采用峰高乘平均峰宽法。 A=1/2h（W0.15W0.85） 式中
27、W0.15和 W0.85分别为峰高015倍和085倍处的峰宽。,定量校正因子,定量方法,1归一化法2外标法 3内标法 4内标对比法,归一化法,前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰依据：组分含量与峰面积成正比,外标法,以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法,a工作曲线法：i纯品工作曲线，同体积样品与之比较 c前提：进入检测器样品量与峰面积成正比 b外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量前提：截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近,注意事项: 结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大每次进样量应一致，否则产生误差,内标法,无待测物纯品，加入样品中不
28、含对照物， 以待测组分和对照物的响应信号对比定量,对内标物要求：a内标物须为原样品中不含组分b内标物与待测物保留时间应接近且R1.5c内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质,内标法优点：进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 适合测定微量组分内标法缺点： 制样要求高；找合适内标物困难；已知校正因子,内标对比法（已知浓度样品对照法）,不需要校正因子进样量对结果影响不大,气相色谱方法开发,1.样品来源及预处理气体液体直接进样,固体溶于溶剂,丙酮,己烷,氯仿,苯常用,避免使用水,二氯甲烷,甲醇作溶剂浓度一般为mg/mL或更低2.仪器配置进样装置,
29、载气,色谱柱,检测器,3.确定初始条件进样量,进样口温度,检测器温度,色谱柱温度,载气流速4. 分离条件优化调节柱温,载气流速,色谱-质谱联用仪,一、概述generalization二、 GC-MS联用技术hyphenated technology of GC-MS三、LC-MS联用仪hyphenated technology of LC-MS,一、概述 generalization,质谱：纯物质结构分析色谱：化合物分离色谱-质谱联用：共同优点GC-MS；LC-MS；CZE-MS（毛细管电泳-质谱）困难点：载气(或流动液)的分离；出峰时间监测；仪器小型化；关键点：接口技术(分子分离器),1 气
30、相色谱-质谱联用仪 (gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS),关键：接口。要求除去载气而使样品无损失地进入质谱仪 GC: 常压；MS: 真空 毛细管柱直接导入电离源 浓缩型接口（填充柱）：喷射式分子分离器GC ：填充柱 毛细管柱均可 MS ：常用四极杆质谱仪 近来还有离子阱和飞行时间质谱仪,(GC/MS)的分析条件,GC: 不同组分在两相中的分配系数不同，先后从色谱柱中流出， 实现分离MS: 连续对分离后的某一组分进行质量数扫描， 得离子流强度随质量数变化的质谱,GC条件：同普通GC (柱类型、固定液种类、汽化温度、载气流量、 进样量、柱温及升温程序等)MS条件：扫描方式，扫描范围（质量），扫描速度, 灯丝电流、倍增器电压（电离）,气相色谱-质谱联用仪,GC-MS的质谱仪部分可以是磁式质谱仪、四极质谱仪，也可以是飞行时间质谱仪和离子阱。目前使用最多的是四极质谱仪。离子源主要是EI源和CI源。,仪器结构,色谱-四极杆质谱仪结构示意图,谢谢大家,
