1、1,MicroRNA-1 在大鼠缺血再灌注损伤中的作用机制以及甘草甜素干预作用研究,在职博士后： 合作导师：,2,研究背景,miRNA是一类非编码小RNA分子，生物学功能广泛，在基因表达过程中，miRNA调控真核细胞约1/3的基因。miRNA 通过与 mRNA 的3UTR（非翻译区）内的靶位点形成局部互补配对来发挥它的转录后调控机制。当miRNA 与其靶 mRNA 的碱基完全配对时，mRNA被进一步降解，当miRNA与其靶mRNA碱基不完全配对时，则表现为对靶 mRNA的翻译抑制。,2,3,研究背景,miRNA能够调节基因的表达在某些生理和病理过程中发挥重要作用，包括心肌缺血/再灌注损伤、心肌
2、梗死、心律失常、心衰等。miRNA 具有高度保守性，并且可以稳定的存在于血清中，易于检测，使之可能成为多种疾病的非侵入性诊断生物标志物。最近的研究结果表明，miR-1可使心肌缺血再灌注损伤加重。,3,4,研究背景,甘草甜素是一种甘草根部提取的活性水溶性组分，具有抗炎特性。,4,5,研究背景,5,甘草甜素的结构,6,研究背景,甘草甜素可以减轻小鼠脊髓损伤后的炎症反应，减轻组织损伤。 Shock 2009，4（31）367-75 甘草甜素可以通过抑制库普弗细胞分泌HMGB1，减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤。 J Pharmacol Exp Ther 2011,1(339) 93-8 甘草甜素可以通过抑
3、制HMGB1，减少心肌细胞凋亡，减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。 Acta Pharmacol Sin，2012,12,6,7,研究假说,1. 心肌缺血再灌注时，miR-1可能与Bcl-2特异性结合，使Bcl-2表达下降，导致心肌细胞凋亡。2.甘草甜素对大鼠缺血再灌注心肌起到保护作用，其机制可能与抑制miR-1表达有关。,7,8,研究目的,1. 证实miR-1是否参与大鼠心肌缺血再灌注损伤。2. 心肌缺血再灌注时，miR-1是否通过Bcl-2特异性结合，使Bcl-2表达下降，导致心肌细胞凋亡。3.甘草甜素对大鼠缺血再灌注心肌起到保护作用，其机制是否与抑制miR-1表达有关。,8,9,研究内容（一）
4、,miR-1在心肌缺血再灌注损伤中的表达及其意义,9,10,材料与方法,试验分组（1）正常对照组/心肌细胞常氧培养组。（2）大鼠缺血再灌注组I/R 组（2h；6h；12h；24h）/心肌细胞 H/R 组（30min；2h；6h；12h）。,10,11,材料与方法,RT-PCR法检测心肌细胞及组织miR-1 mRNA的表达。Northern blot法检测各组大鼠心肌miR-1 的表达RT-PCR法检测大鼠血清miR-1 mRNA的表达。,11,12,结 果,实验各组大鼠心肌miR-1 的表达,12,13,结 果,各组心肌细胞miR-1 mRNA的表达情况,13,14,结 果,实验各组大鼠心肌m
5、iR-1 mRNA的表达,14,15,结 果,实验各组大鼠血清miR-1 mRNA的表达,15,16,研究内容（二）,miR-1在心肌缺血再灌注损伤中的保护机制研究,16,17,材料与方法,试验分组（1）心肌（细胞）缺血再灌注组（2）心肌（细胞）缺血再灌注组+miR-1 ASO组（3）心肌（细胞）缺血再灌注组+miR-1 ASO组+siR-ctrl组（4）心肌（细胞）缺血再灌注组+miR-1 ASO组+siR-Bcl-2组,17,18,材料与方法,TTC法检测实验各组IA/AAR比值。TUNEL法检测大鼠心肌凋亡情况。免疫印迹法检测心肌细胞以及组织Bcl-2蛋白的表达。,18,19,结 果,实
6、验各组IA/AAR比值,19,20,结 果,实验各组心肌Bcl-2蛋白的表达,20,21,结 果,实验各组心细胞Bcl-2蛋白的表达,21,22,结 果,实验各组心肌凋亡的情况,22,23,研究内容（三）,甘草甜素干预对miR-1的影响以及心肌保护作用研究,23,24,材料与方法,试验分组（1）假手术组：共10只，术前7天，每天大鼠尾静脉注射生理盐水1ml，模型建立时只穿线，不结扎, 其余操作完全同其它组,24小时后进行有关指标的检测。（2）缺血再灌注组：共10只，术前7天，每天大鼠尾静脉注射生理盐水1ml。结扎冠状动脉30分钟,放松结扎线后再灌注1小时，造成I/R损伤模型，24小时后进行有关
7、指标的检测。,24,25,材料与方法,试验分组（3）甘草甜素干预组：共10只，术前7天，每天大鼠尾静脉注射甘草甜素预处理（10 mg/kg）。结扎冠状动脉30分钟,放松结扎线后再灌注1小时，造成I/R损伤模型，24小时后进行有关指标的检测。,25,26,材料与方法,HE染色法检测心肌病理变化TUNEL法检测心肌细胞凋亡Northern blot法检测大鼠缺血心肌miR-1的表达,26,27,Sham,NS,GL,建立心肌缺血再灌注模型,HE染色法检测心肌病理变化,TUNEL技术检测心肌细胞凋亡情况,Northern Blot 技术检测RNA表达情况,27,28,结 果,实验各组大鼠心肌病理改变
8、,28,29,结 果,实验各组大鼠心肌细胞凋亡情况,29,30,结 果,实验各组心肌组织miR-1表达的情况,30,31,创新点,证实甘草甜素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。提示甘草甜素的心肌保护机制可能与抑制miR-1表达有关。,31,32,局制性,由于实验条件及实验时间的限制，甘草甜素副作用比如电解质失衡、血管内皮损害等尚待进一步的研究。本研究仅观察miR-1在甘草甜素心肌保护中的作用，其具体分子机制尚需进一步探讨。,32,33,结 论,1. miR-1可能参与了大鼠心肌缺血再灌注损伤。2. 心肌缺血再灌注时，miR-1可能与Bcl-2特异性结合，使Bcl-2表达下降，导致心肌细胞凋亡。3.甘草甜素对大鼠缺血再灌注心肌起到保护作用，其机制可能与抑制miR-1表达有关。,33,34,致 谢,34,35,博士后期间发表的学术论文,35,36,谢谢,36,
