1、实验六 食品中大肠菌群的测定一、概述(一)大肠菌群的定义及范围根据国家 1994 年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在 37、24h 能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表 5-4。表 5-4 大肠菌群生化特性分类表靛基质甲基红V-P 拘橼酸H2S 明胶 动力 44.5乳糖大肠艾希氏菌 + + +/- +大肠艾希氏菌 + +/- 大肠艾希氏菌 + + +/- 费劳地拘橼酸杆菌 + + +/-
2、 +/- 费劳地拘橼酸杆菌 + + + +/- +/- 产气克雷伯氏菌 + 产气克雷伯氏菌 + + + 阴沟肠杆菌 + + + +/- 注：+，表示阳性；，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌 I 型和型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P 和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一” ，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。(二)大肠菌群的测定意义1、粪便污染的指标细菌早在 1892 年，沙尔丁格(Schardinger) 氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一
3、年后，塞乌博耳德“斯密斯(TheoboldSmith) 氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：10 8 个g 一 109 个g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，
4、只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。2粪便污染指标菌的选择作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。检验方法简便，易于检出和计数。在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜
5、的。另外，作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌( Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的 50以上，一般粪便中该菌量为 109 个g10 10 个g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为，在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群链球菌对低温抵抗
6、力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处：饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。3大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然
7、界存在的主要原因。在腹泻患者所排粪便中，非典型大肠杆菌常有增多趋势，这可能与机体肠道发生紊乱，大肠菌群在型别组成的比例上因而发生改变所致；随粪便排至外环境中的典型大肠杆菌，也可因条件的改变。使生化性状发生变异，因而转变为非典型大肠杆菌。由此看来，大肠菌群无论；庄粪便内还是在外环境中，都是作为一个整体而存在的，它的菌型组成往往是多种的，只是在比例上，因条件不同而有差异。因此，大肠菌群的检出，不仅反映校样被粪便污染总的情况，而且在一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，所以具有广泛的卫生学意义。由于大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验项目，如果食品中大
8、肠菌群超过规定的限量，则表示该食品有被粪便污染的可能，而粪便如果是来自肠道致病菌者或者腹泻患者，该食品即有可能污染肠道致病菌。所以，凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品食用是不安全的。二、实验目的1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。2、学习并掌握大肠菌群的检验方法。三、原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每 100g（或 ml）检
9、样内大肠菌群最近似数（the most probable number 简称 MPN）表示。三、材料1、样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2、菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes）3、培养基及试剂单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB ） 、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA)4、其它设备和材料温箱(36 土 1)、水浴锅(44 土 0.5)、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。四、实验步骤(一)检验程
10、序大肠菌群检验程序见图 52(二)操作步骤1采样及稀释以无菌操作将校样 25g(或 25mL)放于含有 225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内( 瓶内预置适当数量的玻璃珠 )或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以 800rmjn1000rmin 的速度处理 1min，做成 1：10 的稀释液。用 1mL 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1mL，注入含有 9mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成 1：100 的稀释液，换用 1 支 lmL 灭菌吸管，按上述操作依次作 10 倍递增稀释液。根据食品卫生要求或对检验样品污染
11、情况的估计按种 3 管。也可直接用样品接种。2乳糖初发酵试验即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内，接种量在 1mL 以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1mL 及 1mL 以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种 3 管，置(36 土 1)培养箱内，培养(24 土 2)h，的所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，勿有产生者，则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。3分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置(36 土 1)温箱内，培养 18h 一 24h，：然后取出，观察菌落形态并作革兰
12、氏染色镜检和复发酵试验。4乳糖复发酵试验即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群 12 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置(36 士 l)的温箱内培养 (24 土 2)h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。5报告检样稀释乳糖胆盐发酵管361，242h不产气大肠杆菌阴性报告产气伊红美蓝琼脂平板361，18-24h革兰氏染色 乳糖发酵管361，242h革兰氏阳性大肠菌群阴
13、性报告革兰氏阴性无芽孢杆菌 产气不产气大肠菌群阳性 大肠菌群阴性报告 报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查 MPN 检索表(见表 54)，报告每 100mL(8)食品中大肠菌群的最可能数。MPN 检索表阳性管数 95%可信限1mL(g)3 0.1mL(g)3 0.01mL(g)3MPN100mL(g) 下限 上限000000000123303060905 900000111101233060901205 130000022220123609012016000003333012390130160190111100000123407011015051020021011111111012370110
14、150190103023036011112222012311015020024030 360111133330123160200240290续表阳性管数 95%可信限1mL(g)3 0.1mL(g)3 0.01mL(g)3MPN100mL(g) 下限 上限2200019014030703603702200232002602222111101231502002703403070440890222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033
15、331111012348075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000注：1.本表采用 3 个稀释度1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)，每稀释度 3 管。2.表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)、0.1mL(g)，表内数字应相应降低 10 倍；如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)、0.001mL(g)时，则表内数字应相应增 10 倍，其余类推。
