1、小黑豆相关生理指标测定1. 表型变化:鲜重、株高、主根长和叶面积鲜重 :取处理好的植株,擦干根和叶表面水分,测量整株植物的重量 ,每个测 6个重复。株高 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度 ,记录,每个 测 6个重复。主根长 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到主根最 远点长度,记录,每个 测 6个重复。叶面积 :取处理好的植株,选择第二节段的叶片,测量叶面 积,叶面积测量方法 是测每个叶片最宽处长度作为叶的长, 测叶片最窄处长度作为叶的宽, 叶片长和 宽的乘积即为叶表面积。每个 测 6个重复。2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA 和 H2O2含量测定样品处理:取 0.
2、5g 样品(叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净 ,速在 液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨,然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.4 抽提, 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中, 于 4, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20下 ,上清液可用于 总蛋白、丙二醛(MDA 、可溶性糖和 H2O2含 量测定。总蛋白测定(Bradford 法 : 样品反应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul 样 品 , 空 白对 照 为(800ul H2O+200ul Bradford 。 测 定 后 带 入 标 准 曲 线 Y=32.54
3、9X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,计算得出蛋白含量。可溶性糖测定:样品反应体系(1ml 蒽酮 +180ul ddH2O+20ul样品提取液 ; 空 白 对 照 (1ml 蒽 酮 +180ul ddH2O , 测 定 OD625 后 带 入 标 准 曲 线 : Y=0.0345X+0.0204(Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量 (ug 蒽酮配方:称取 100mg 蒽酮溶于 100ml 稀硫酸(76ml 浓硫酸 +30mlH2O . 注意: 浓硫酸加入水中时,一点一点递加,小心溅出受 伤。丙二醛 (MDA 测定:在酸性和高温条件下, 丙二醛可与硫代巴比妥 (TB
4、A 反应生成红棕色的 3,5,5-三甲基恶唑 2,4-二酮,在 532nm 处有最大吸收波长,但 该反应受可溶性糖的极大干扰,糖与 TBA 的反应产物在 532nm 处也有吸收,但 其最大吸收波长在 450nm 处。采用双 组分分光光度法 ,可计算出 MDA 含量。 MDA 的计算公式为:MDA (umol/L =6.45OD532-0.56OD450.反应体系为:400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品, 80水浴 10min 后, 测 OD532和 OD450。对照用 Tris-HCl.0.6%TBA配方:称取硫代巴比妥 0.6g ,溶于少量 1M NaOH中,待其完全
5、 溶解后用 10%TCA(称取 10gTCA 三 氯乙酸,溶于 100ml 蒸馏水中,待其溶解 即可定容至 100ml 。H2O2测定(二甲酚橙法 :样品反应体系(82ul 溶液 A+820ul溶液 B (A:B=1:10 +150ul样品提取液 , 30水浴 30min ,测 OD560。 标准曲线 为 :Y=0.01734X-0.0555(Y代表 OD560, X 代表 H2O2含量 溶液 A (200ml :FeSO4.7H2O 0.1835g; (NH42SO4 0.0872g; H2SO4(浓硫 酸 18M4.58ml ,加水定容。溶液 B (200ml :二甲酚橙 0.0234g
6、;山梨醇 6g ,加水定容到 200ml3. 可溶性蛋白、 SOD 、 POD 和 CAT 活性测定样品处理:取 0.5g 样品,速在液氮中冻存,在遇冷的研 钵中加液氮研磨, 然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.0 (内含有 20% 甘油、 1mmol/L ASA(抗坏血 酸 、 1mmol/L DTT(二硫 苏糖醇 、 1mmol/L EDTA、 1mmol/L GSH(还原型谷 胱甘肽 、 5mmol/L MgCl2抽提,将抽提液 转移到 2ml 的 EP 管中,于 4 , 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20 下, 上清液可用于可溶性蛋白、
7、SOD 、 POD 和 CAT 含量测定。1mmol/L的 ASA 配制:先配制 10mmol/L的母液称取 176.13mg 的 ASA , 溶于 100ml 的 Tris-HCl (pH7.0中即可,然后稀释 10倍即可。1mmol/L的 DTT 配制:先配制 10mmol/L的母液称取 154.25mg 的 DDT 溶于 100 ml的 Tris-HCl (pH7.0中即可,然后稀释 10倍即可。1mmol/L的 EDTA 配制:用 30mmol/L的 EDTA 稀释 30倍即可。5mmol/L的 MgCl2 配制:称取 MgCl2.6H2O 的 101.5mg 溶于 100ml 的 T
8、ris-HCl (pH7.0 ,即可。样品提取液的配制(200ml :取 10mmol/L的 ASA 母液 20ml , 10mmol/L的母液 DTT20ml , 取 30mmol/L的 EDTA 母液 7ml , 称取 203mg 的 MgCl2.6H2O , 最后再量取 20ml 的甘油,将最终体积定容到 200ml ,即可。可 溶 性 蛋 白 测 定 (Bradford 法 :样 品 反 应 体 系 (800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品 ,空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford 。测定后带入标准 曲线 Y=32.549X-0.224(Y代
9、表蛋白含量, X 代表 OD595 , 计算得出蛋白含量。SOD 测定 :SOD 活性的测 定是根据照光时,体系中产生氧自由基使硝基四 唑蓝还原成蓝色甲 (在 560nm 处有一吸收峰 , 而超氧化物歧化 酶作为氧自由基 的清除剂可抑制此反应。 一个酶活单位定义为将硝基四 唑蓝的还原抑制到对照 一半 (50% 时 所需的酶量。14.5mmol/L的 dl-甲硫氨酸(分子量 149.21 (现用现配 : 称取甲硫氨酸 216.4mg ,加少量 Tris-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0 定容到 100ml ,即 可。30mmol/L的 EDTA (292.25 (现用现
10、配 :称取 EDTA 药品 876.75mg ,加 少量 Tris-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0 定容到 100ml ,即可。2.25mmol/L的 NBT (硝基四唑蓝 (817.6 (现用现配 :称取 NBT 药品 183.96mg ,加少量 Tris-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0 定容到 100ml ,即 可。60umol/L的核黄素 (376.36(现用现配 :先称取 225.81mg 的核黄素,加少 量 50mM Tris-HCl(pH7.4溶解后, 用 50mM Tris-HCl(pH7.4定容到 10ml , 配制成 6
11、0mmol/L的母液,然后取 100ul 到 100ml 的 Tris-HCl(pH7.4中,即可配制成 60umol/L的核黄素。测酶活的反应介质 :测定前在 54ml 的 14.5mmol/L的 dl-甲硫氨酸中分别加 入 EDTA 、 NBT 和核黄素各 2ml ,此为反应混合液。酶活测定:在盛有 1.0ml 反应液的试管中,加入适量的酶液(50ul (以抑 制达 50%作用 酶浓 度为最佳 。混匀后放在透明的试管架上,于光照培养箱中准 确照光 10min 后,迅速测定 560nm 处的光密度。以不加 酶液照光液的为对照, 计算反应被抑制的百分比。按下式计算超氧化物歧化酶的活性 A N酶
12、活力 =AOW T V 50%式中:酶活力单位为每 min 每g鲜重酶活单位数;AO为对照试管溶液在 560nm 处的吸光度值 ; A 为对照试管溶液在 560nm 处的吸光值与加入酶 液的反应液在 560nm 处 的吸光值的差 ; N为酶液总体积; W 为提取酶液的样品鲜重 g ; T 为照光时间 (10min; V 为加入酶液的体积 (ml;POD 测定(愈创木酚法 :过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。 在有过氧化氢存在下, 过氧化物酶能使愈创木酚氧化, 生成茶褐色物质, 可用分 光光度计测量生成物的含量。反应混合液配制:在 50ml 的 50mmol/L的 Tris-HCl(pH
13、7.0缓冲液中加入 28ul 的愈创木酚,与磁力搅拌器上加热搅拌直至愈创木酚溶解,再加入 19ul 的 30% 的 H2O2,混合均匀, 4保存。酶活测定:取反应混合液 1.0ml , 加入 0.1ml 酶提取液 , 2min 前后, 于 470nm 处测 OD 值,每隔 1min 读数一次,以每分钟 OD 值的变化表示酶活大小。 (测量 时再加入酶液CAT 测定(H2O2法反应缓冲液:20mM 的 H2O2,使用前在 25水浴中加热 30min 。酶活测定:取反应液 1.4ml ,加入 100ul 酶液,每加完一管立即计时,并迅 速在波长 240nm 下测定 30S 、 1min30S 、
14、2min30S 时的吸光度,以 Tris-HCl 的 作为空白。以 1min 内 A240减少 0.1的酶量为 1个酶活单位。代入酶活力公式, 以 OD*V/0.1*v*t FW表示 CAT 活性,所有测定均重复三次。 OD 代表 空 白的吸光度 -样品管的吸光度 ; V 代表酶提取液的总体积, v 代表测量是加入的样 品体积; t 代表反应时间 min , FW 代表样品鲜重。0.1mol/LH2O2 配方:称取 1.1333g 的 30%的 H2O2, 加入 100ml 的 50mmol/L 的 Tris-HCl(pH7.4,即可。也可以用 0.01%的 H2O2。4. 叶绿素含量测定样品处理及测定 :取 0.1g 样品,速于液氮中冻存,在遇冷的研 钵中加液氮 研磨, 然后加入 1.5ml 的 95%乙醇抽提, 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中, 于 4, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 上清用于叶绿素含量测定。 测 OD665和 OD649。 空白对照为 95%乙醇。Ca=13.95OD665-6.88OD649Cb=24.96OD649-7.32OD665总叶绿素 =Ca+Cb
