1、2.1.8 转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有 0.5% NaCl 的 MS 固体培养上进行胁迫培养，培养条件为 27±1，每天 13 h、3000 lux 光照。胁迫培养 4 w 后，取其叶片测定其SOD 活性，每个样品设 3 次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.8.1 主要试剂及配方（1 ） 0.1 mol/l pH 7.8 磷酸钠（ Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A 液（0.1 mol/l Na2HPO4 溶液）：称取 Na2HPO4·12H2O 7.163 g，用少量蒸馏水溶解后定容至 20
2、0 ml，4冰箱中保存备用；B 液（0.1 mol/l NaH2PO4 溶液）：称取 NaH2PO4·2H2O 0.780 g，用少量蒸馏水溶解后定容至 50 ml，4 冰箱中保存备用；取上述 A 液 183 ml 与 B 液 17ml 充分混匀后即为 0.1 mol/l pH 7.8 的磷酸钠缓冲液，4冰箱中保存备用。（2 ） 0.026 mol/l 甲硫氨酸（ Met）磷酸钠缓冲液称取甲硫氨酸（C 5H11NO2S）0.388 g，用少量 0.1 mol/l pH 7.8 的磷酸钠缓冲液溶解后，再用相同磷酸钠缓冲液定容至 100 ml，现用现配，4 冰箱中保存可用 12 d。（3
3、 ） 7.5 × 10-4 mol/l NBT 溶液称取 NBT（C 40H30Cl2N10O6）0.153 g，用少量蒸馏水溶解后，定容至 250 ml，现用现配，4 冰箱中保存可用 23 d。（4 ）含 1.0 mol/l EDTA 的 20 mol/l 核黄素溶液A 液：称取 EDTA 0.003 g，用少量蒸馏水溶解；B 液：称取核黄素 0.075 g，用少量蒸馏水溶解；C 液：合并 A 液和 B 液，定容至 100 ml，此溶液即为含 0.1 mmol/l EDTA 的 2 mmol/l 核黄素溶液，避光保存（可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好） ，4 冰箱中可保存 810 d
4、，当测定 SOD 酶活时，将 C 液稀释 100 倍，即为含 1.0 mol/l EDTA 的 20 mol/l 核黄素溶液。（5 ）含 2% PVP 的 0.05 mol/l pH7.8 磷酸钠缓冲液取 0.1 mol/l pH7.8 的磷酸钠缓冲液 50 ml，加入 2 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮） ，充分溶解后移入 100 ml 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀， 4 冰箱中保存备用。2.1.8.2 提取及测定方法（1）称取 1.0 g 样品叶片于预冷的研钵中，加入 4 ml 预冷的提取介质（含 2% PVP 的0.05 mol/l pH7.8 磷酸钠缓冲液） ，冰浴研磨匀浆，转入
5、10 ml 离心管，并用提取介质定容至5 ml；（2）4 10000 rpm 离心 10 min，取上清即为酶液提取样品；（3）取透明度好的 10 ml 离心管，每个株系 3 次重复，按照下表加入试剂：试剂 用量（ml）0.05 mol/l 磷酸缓冲液（2% PVP） 0.8750.026 mol/l Met 缓冲液 1.5750 mol/l NBT 0.31 mol/l EDTA 及 20 mol/l 核黄素 0.3酶提取液（对照管以磷酸缓冲液代替） 0.025总体积 3.0（4）设 3 个对照（CK 1、CK 2、CK 3） ，将 CK1 包上铝箔避光，与其它样品管（包括CK2 和 CK3
6、）同时置于 4500 lux 日光灯下反应 25 min，反应温度 28；（5）SOD 活性测定与计算：至反应结束，立即用黑布遮蔽以终止反应。以遮光的对照管 CK1 作为空白调零，在 560nm 波长下测定各管的吸光度，CK 2 和 CK3 的平均值作为对照，按下例公式计算 SOD 活性（SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50%为一个酶活性单位）：SOD 活性（ U/g）= （OD 0 -OD560）×V T（OD 0×0.5×FW×V1）OD 0光照对照管的光吸收值；OD 560样品管的光吸收值；VT样液总体积（ml） ；V1测定时样品用量（
7、ml） ；FW样品鲜重（g） 。2.1.9 转基因植株在盐胁迫下的丙二醛(MDA)含量测定将转基因植株与对照植株继代于含有 0.5%NaCl 的 MS 固体培养上进行胁迫培养，培养条件为 27±1，每天 13 h、3000 lux 光照。胁迫培养 4 w 后，取整株测定其丙二醛含量，每个样品设 3 次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.9.1 主要试剂及配方（1）5%三氯乙酸（TCA）：称取 5 g 三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，再定容至100ml；（2）0.5%硫代巴比妥酸（TBA ）：称取 0.5 g 硫代巴比妥酸，用 5%TCA 定容至 100 ml。2.1.9.2 提取
8、及测定方法（1）称取 1.0 g 材料，加入 10 ml 5%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨至匀浆；（2）3000 rpm 离心 10 min，取上清即为丙二醛提取液；（3）取 1.5 ml 上述提取液（对照管取 1.5 ml 5% TCA） ，加入 2.5 ml 0.5% TBA，混匀后于沸水浴中反应 15 min，迅速冷却；（4）1800 g 离心 10 min；（5）取上清液测定 532 和 600 nm 波长处的吸光度，以蒸馏水调零；（6）含量计算：丙二醛含量（nmol/g）= （OD 532-OD600）×A ×V /（0.155 ×FW×
9、;a）OD532样品管在 532 nm 处的光吸收值；OD600样品管在 600 nm 处的光吸收值 ；A反应液总体积（ml） ；V提取液总体积（ml） ；FW样品鲜重（g） ；a测定用液总体积（ml） 。2.1.10 转基因植株在盐胁迫下的脯氨酸含量测定将转基因植株与对照植株继代于含有 0.5%NaCl 的 MS 固体培养上进行胁迫培养，培养条件为 27±1，每天 13 h、3000 lux 光照。胁迫培养 4 w 后，取其叶片测定其脯氨酸含量，每个样品设 3 次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.10.1 主要试剂及配方（1）6 mol/l 磷酸：量取 102.5 ml 8
10、5%的磷酸，定容至 250 ml；（2）2.5% 酸性茚三酮：称取 2.5 g 茚三酮，加入 60 ml 冰醋酸和 40 ml 6 mol/l 磷酸，于 70 下加热溶解，冷却后贮存于棕色瓶中尽快使用，4可保存 3 d。2.1.10.2 提取及测定方法实验分为脯氨酸标准曲线的制作和植物样品的提取及测定两个部分，具体步骤如下：脯氨酸标准曲线的制作：（1）称取 10 mg 脯氨酸溶于少量无水乙醇中，用蒸馏水定容至 100 ml，配成 100 g/ml的母液；（2）取上述母液 0，1.25，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15 ml 分别放入 8 个 25 ml 的容量瓶中，再分别加入蒸馏水
11、定容至 25 ml，配制成 0，2.5，5.0，10，15，20，25，30 g/ml系列浓度的溶液；（3）分别取上述溶液 2 ml，加入 2 ml 冰醋酸，2 ml 酸性茚三酮（注意不要接触皮肤） ，摇匀，沸水浴显色 15 min，冷却后于 520 nm 处测 OD 值；（4）以 OD 值为横坐标，脯氨酸含量为纵坐标，绘制标准曲线。植物样品中脯氨酸的提取及测定：（1）称取胁迫处理过的植株叶片 1.0 g，剪碎，加入 5 ml 80% 乙醇于研钵中研磨成匀浆；（2）将匀浆液体全部转移至 25 ml 刻度的试管中，加水补足 25 ml，混匀，80水浴提取 20 min；（3）加入 0.5 g 人
12、造沸石，0.2 g 活性炭，于振荡器上振荡 1 min 混匀，过滤；（4）取 2.5 ml 滤液，按制作标准曲线的方法测定各个样品的 OD 值；（5）从制作得到的标准曲线上检出被测样品中脯氨酸的含量，最后换算得到游离脯氨酸的平均含量：脯氨酸含量（g/g）= （C×V/a）/FWC曲线查 C 值（g ） ；V提取液总体积（ml） ；a测定液体积（ml） ；FW样品质量（g） 。2.1.11 转基因植株在盐胁迫下的叶绿素含量测定将转基因植株与对照植株继代于含有 0.5%NaCl 的 MS 固体培养上进行胁迫培养，培养条件为 27±1，每天 13 h、3000 lux 光照。胁迫
13、培养 4 w 后，取其叶片测定其叶绿素含量，每个样品设 3 次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.11.1 主要试剂及配方80% 丙酮：量取 80ml 丙酮，定容至 100 ml。2.1.11.2 提取及测定方法（1）称取胁迫处理过的植株叶片 0.2 g，剪碎至研钵中，加入 5 ml 80% 的丙酮，研成匀浆；(2) 用一层加丙酮润过的滤纸过滤，再用少量丙酮将滤纸和研钵上的色素冲洗干净，定容至 10 ml，摇匀；(3) 吸取 2 ml 含有叶绿素的丙酮提取液，加 80% 的丙酮 2 ml 稀释后，倒入比色杯中，用分光光度计分别在 645 nm、663 nm、652 nm 下测吸光度，以 80% 丙酮为空白对照。用下列公式计算： Ca(mg/l)=12.7OD6632.69 OD 645 Cb(mg/l)=22.9 OD 6454.68 OD 663 Ct1(mg/l)= 8.02 OD 66320.21 OD 645 用下式计算叶绿素在叶片中的含量：Ct（叶绿素 mg/g 鲜重）= Ct1×提取液总量×稀释倍数×10 -3/样品（g）
