1、1,蛋白质组学与分析技术,邱德文中国农科院植物保护研究所 2010。3。24,2,蛋白质的分离纯化方法,（一）根据分子大小不同的纯化方法1、透析和超过滤,利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料,3,利用溶解度差别的纯化方法,1.等电点沉淀调整溶液pH不同蛋白在各自 pI处依次沉淀2.盐溶和盐析,3.有机溶剂分级分离法,降低介电常数 争夺水化膜,4,蛋白沉淀步骤,硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀 TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白质可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCA 丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉
2、淀，离心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除 在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液 用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗,5,聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构 等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质,6,聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过丙烯酰胺单体和N，
3、N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构 等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质,7,8,等电聚焦电泳,9,双向电泳,10,胶上蛋白的检测,蛋白质检测常用考马斯亮蓝染色 银染 负染 荧光标记、同位素标记，提高灵敏度和自动化水平,11,层析分离纯化技术,12,蛋白质层析分离纯化技术,蛋白质薄层层析（硅胶板+层析缸） 蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料） 蛋白质分析制备仪,13,14,15,16,17,18,19,
4、20,21,层析分离技术(chromatography),层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。,22,凝胶过滤层析(gel filtration chromatography),凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。,三种不同的蛋白质根据它们大小的不同在层析柱中被分离。,23,亲和层析(affinity chromatography),在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别
5、结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。,琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异的受体结合(胰岛素),24,离子交换层析(ion-exchange chromatography),离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法 .,通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。,25,柱层析分离,常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。柱子可以分为：加压，常压，减压
6、。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所 以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长.减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发，以前曾经大量的过 减压柱，但是自从尝试了加压后，就很少使用减压柱色谱了。,26,蛋白质分析制备仪,27,选择纯化设备,纯化需要 MicroSpin Syringe + KTA 系统 + Purification HiTrap HiTrap Modules columns columns 快速，高处理量筛选 (GST or (His)6 融合蛋白) 非常快速，一步纯化 (适合大部分融合蛋白
7、) 一步纯化 (适合大部分融合蛋白) 优化以提高纯度 常规实验，重复性好 纯化后蛋白复性 ,28,HiTrap Chelating,准备柱子 用 H2O 洗 加 NiSO4 再用 H2O 洗,加样 用平衡缓冲液冲洗柱子,废液,收集,用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白,收集组份,3 min,5-15 min,2 min,用平衡缓冲液平衡柱子,废液,3 min,29,高效纯化策略,粗提,纯化,精细纯化,载量,速度,分辩率,回收率,30,准备工作,考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济,蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点,31,pH 的重要性: 蛋白质净电荷随
8、pH 改变,滴定曲线,不同 pH 下的分离情况,2,1,+,-,32,pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变,流动相的 pH 选择性,33,样品准备,考虑: 根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 稳定样品,34,三步纯化策略,35,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,层析填料的 颗粒大小,中度纯化,36,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,流速,中度纯化,37,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,分辩率,中度纯化,38,粗提,目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用
9、层析技术: 离子交换 / 疏水层析,分辩率,快速,回收率,载量,39,粗提: 离子交换填料,预装柱 20ml 颗粒大小 流速 HiPrep 16/10 Q XL & SP XL 90 m 10 ml/min HiPrep 16/10 DEAE & CM 90 m 10 ml/min,Sepharose Big Beads,STREAMLINE,Sepharose Fast Flow,40,粗提: 疏水层析填料,高载量 高流速,HiPrep 16/10 Phenyl (高 & 低取代) HiPrep 16/10 Butyl HiPrep 16/10 Octyl,HiTrap HIC 选择试剂盒,
10、放大,41,中度纯化,目的 去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析,HiLoad 离子交换和疏水层析预装柱,分辩率,快速,回收率,载量,42,中度纯化: 离子交换填料,Sepharose HP 34 m,Q & SP,150 cm/hr,小包装和预装柱,交联琼脂醣,SOURCE 30 m,Sepharose High Performance,SOURCE 30,Q & S,1 800 cm/hr,聚苯乙烯/二乙烯基苯,小包装,43,中度纯化:疏水层析填料,Sepharose HP 34 m,苯基,300 cm/hr,小包装和预装柱,44,回收率,载量,精细纯化,目的 达到最终
11、纯度 (去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术: 凝焦过滤/离子交换 / 疏水层析/反相层析,分辩率,速度,45,精细纯化: 凝胶过滤填料,Superdex Peptide,Superdex 200,Superdex 75,Mr 3 000 - 70 000,Mr 100 - 7 000,Mr 10 000 - 600 000,分离分子量大小 (球状蛋白质),102 103 104 105 106,用 prep grade (34 m) 放大,HR 预装柱 (13 m),46,精细纯化: 凝胶过滤填料,Superdex 30 pg,Superdex 200 pg,Superdex 75,分离
12、分子量大小 (球状蛋白质),102 103 104 105 106,Prep Grade (34 m),有HiLoad 预装柱和小包装填料,Mr 100 - 7 000,Mr 3 000 - 70 000,Mr 10 000 - 600 000,47,精细纯化:离子交换填料,Mono Beads Q & S,10 m: Mono Q & S, 25 mg 上样载量,3 m: Mini Q & S,Mini Beads Q & S, 2 mg上样载量,48,精细纯化:离子交换和疏水层析填料,RESOURCE 15 m,Q, S, Phenyl, Ether, Isopropyl,1 ml 预装柱
13、流速高达 10 ml/min,RESOURCE HIC Test Kit,49,精细纯化:反相层析填料,Sephasil,RPC,SOURCE RPC,硅胶,3 m,C2/C18,聚苯乙烯/二乙烯基苯,120 : 肽类,C4, C8, C18,5 and 12 m,硅胶,100 : 肽类 300 : 蛋白质,pH 1 - 12 (14),肽类,5, 15 and 30 m,50,Source,30 m,15 m,5 m,离子交换/疏水层析/反相层析,反相层析,离子交换/反相层析,51,适用於三步纯化策略的层析技术,蛋白质性质 层析技术 净电荷 离子交换(IEX) 大小 凝胶过滤(GF) 疏水性
14、 疏水层析(HIC), 反相层析(RPC) 生物辩识 (配基特异性) 亲和层析(AC) 配基特异性，净电荷, 扩张柱床吸附技术 (EBA) 疏水性 有AC, IEX or HIC,52,适用於三步纯化策略的层析技术,层析技术,主要特色,粗提,中度纯化,精细纯化,IEX,高分辨率 高载量 快速,HIC,分辨率好 载量一般 快速,AC,高分辨率 高载量 快速,GF,高分辨率,RPC,高分辨率,53,适用於三步纯化策略的层析技术,层析技术,样品起始状态,样品结束状态,IEX,低离子强度,高离子强度或 pH 改变,样品体积不受限制,样品被浓缩,HIC,高离子强度,低离子强度,样品被浓缩,AC,特异性结
15、合,特异性洗脱条件,样品体积不受限制,样品被浓缩,GF,样品体积受限制,交换缓冲液,(5% 总柱体积),流速受限制,样品被稀释,RPC,需要有机溶剂,在有机溶剂中，或会损失,生物活性,样品体积不受限制,54,纯化工艺中不同层析技术的衔接,一般准则: 结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不同层析技术(e.g. IEX, HIC and GF) 减少不同层析技术间的样品处理(e.g. 浓缩, 交换缓冲液) 尽量简单,55,衔接层析技术时注意事项,层析技术,结束情况,起始条件,小量样品,GF,低离子强度,IEX,高离子强度或 pH 改变,高离子强度,HIC,低离子强度,特异性结合条件,AC,特异
16、性洗脱条件,样品稀释 交换缓冲液 (如果需要),56,合理衔接不同层析技术,低溶解度的蛋白质,SDS,萃取,SDS,萃取,溶解试剂,(尿素, 乙二醇,非离子性清洁剂),GF,(在非离子性清洁剂中),HIC,HIC,GF,GF,57,合理衔接不同层析技术,粗样或样品含高盐,GF,脱盐,GF,脱盐,GF,脱盐,AC,IEX,HIC,或者需要稀释,IEX,IEX,HIC,GF,或,RPC,GF,或,RPC,GF,GF,样品澄清,粗提,中度纯化,精细纯化,58,合理衔接不同层析技术,样品非常澄清或很稀,AC,IEX,IEX,沉淀,(e.g. 在高离子强度下),HIC,重新溶解,GF,作含高盐样品处理,
17、粗提,中度纯化,精细纯化,GF,或,RPC,GF,或,RPC,59,一种不稳定，氧气敏感酶的纯化，结晶和三维结构测定 Purification of a labile, oxygen-sensitive enzyme for crystallization and 3D structure determination,一个可溶性，非融合蛋白质的 多维纯化,去乙酰氧化头孢菌素 C 合成酶 Deacetoxycephalosporin C synthase (DAOCS),Rama Bhikhabhai and Helena Hedlund, Amersham Pharmacia Biotech
18、联合合作 Matthew Lloyd and Christopher Schofield, Oxford Centre for Molecular Sciences, Oxford, UK Inger Andersson, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden,60,DAOCS去乙酰氧化头孢菌素 C 合成酶,D-AA = d-(D-a-aminoadipoyl),主要参与在头孢菌素和来自链丝菌 clavuligerus 中青霉素 N 的头霉菌素的生物合成 属于非红血素类亚铁依赖性的氧化酶,青霉素 N,去乙酰氧化
19、头孢菌素 C,61,DAOCS - 纯化策略,纯化目标,DAOCS定性,准备样品,精细纯化,粗提,快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting),中度纯化,快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting),62,DAOCS - 纯化,目标 得到 5-10 mg DAOCS，纯度足够进行结晶和 X-射线绕射分析 在一个工作天内完成整个纯化流程 工艺可放大最少 10 倍.,63,结晶纯需要,大分子均一性 - 其他, 污染性蛋白质 序列均一性 - 蛋白水解片段 - 转译后修饰 - 其他修饰 (氧化等) 构象均一性 - 聚合 - 失活,要拿到高纯度结晶，必
20、须 使用纯和均匀的蛋白质,64,DAOCS - 定性,参数等电点 分子量盐稳定性一般稳定性,对纯化设计的影响在粗提时使用中性 pH 进行阴离子交换层析用 Superdex 75 prep grade 凝胶过滤技术进行精细纯化可以使用疏水层析在缓冲液中加 DTT 工艺设计重点缩短整体纯化时间,数值4.834 5002 M (NH4)2SO4容易氧化,65,DAOCS - 一般准则,在所有缓冲液中加 DTT 使所有半胱氨酸残基保持还原状态 加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性 用 SDS PAGE 检查每一个组份中 DAOCS 利用酶测定法测量生物活性,66,准备样品,悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中超声震荡
21、破碎细胞DNA 沉淀利用离心沉淀,来源:从 S. Clavuligerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大肠杆菌的胞浆中扩增,67,选择粗提的层析技术,阴离子交换: 快速, 浓缩 样品处理最简单 分离基础: 电荷 因为 DACOS 的酸性 pI 和不稳定性，所以缓冲液选择中性 pH,68,粗提 - 在 KTAFPLC 上优化梯度,层析柱: HiPrep 16/10 Q XL 系统: KTAFPLC,69,选择中度纯化技术,HIC: 分离基础: 疏水性 蛋白质疏水性质很难预测: 筛选适合填料 HIC 可以跟 IEX 互补衔接, 减少样品处理步骤 (只需要加盐) DAOCS 在高盐下能保持稳定
22、,70,选择精细纯化的层析技术,GF:分离基础: 分子量差异 GF: 最适合分离双体，寡聚体和聚合物,71,DAOCS - 优化好的粗提步骤,层析柱: HiPrep 16/10 Q XL 系统: KTAFPLC,浓缩样品 快速去除有害物质,72,DAOCS -优化好的中度纯化步骤,层析柱: SOURCE 15ISO 内径 16 mm, 长度 50 mm 系统: KTAFPLC,HIC 和 IEX 互补 浓缩样品 除去大部分杂质,73,DAOCS -优化好的精细纯化步骤,层析柱: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade 系统: KTAFPLC,去除聚合物和余下的少
23、量污染物 交换缓冲液,74,DAOCS - 用 SDS-PAGE 分析,4,3,2,1,M,M,M - LMW 低分子量标记 1 - 样品 2 - 组份 - Q Sepharose XL 3 - 组份- SOURCE 15ISO 4 - 组份- Superdex 75 pg,67k 43k,30k,75,DAOCS 纯化 - 结果,粗提,中度纯化,精细纯化,76,DAOCS 纯化 - 结果,DAOCS 的高分辨电子密度图谱,结晶 DAOCS 的 X-射线绕射图,感谢瑞典农业科技大学的 Prof. Inger Andersson 和 Dr. Anke Terwisscha van Schelti
24、nga, 以及瑞典 Uppsala 大学生化系的 Dr. Karin Valegrd 提供以上图片,77,中度纯化,DAOCS 纯化 - 总结,工艺 优化快速探索填料(scouting) 快速探索梯度(scouting)快速探索填料(scouting) 快速探索梯度(scouting),优化好的纯化流程样品准备HiPrep 16/10 Q XLSOURCE 15ISOHiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade,粗提,精细纯化,浓缩,60 分钟,30分钟,40分钟,120分钟,80分钟,时间,浓缩,78,KTA 平台层析系统纯化 DAOCS - 结论,DAOCS 纯度足够进行结晶 使用 KTA 平台层析系统的模板和快速探索 (scouting) 功能可以快捷有效地优化纯化工艺 纯化时间从 3 天减少到 6 小时,79,请参考中文网站, ,
