1、2630 主堡医堂盘查!Q!i生!旦!旦筮!鲞笠丝翅盟!丛盟!i塑：垒!理塾箜：!：y!：堕：塑!：!人脐带间充质干细胞外泌体免疫调节功能的研究刘明 汪劲松刘沐芸 胡祥徐军【摘要】 目的探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)分泌的外泌体(exosomes)的免疫调节能力。方法分离培养hUC-MSCs，收集第3代hueMSCs上清，提取外泌体，Western印迹检测其表面特异标志CD81、CD9的表达，BCA法测定浓度；不同浓度外泌体与CD3CD28单抗刺激的正常人外周血单个核细胞(PBMC)作用72 h，流式检测作用前后Thl7和Treg细胞的比例变化，检测对CD4+T、CD8+T细胞增殖
2、能力的影响，ELISA检测干扰素(IFN)一y、白细胞介素(IL)_6、肿瘤坏死因子0【(TNF一0【)、转化生长因子B1(TGF一131)的水平变化。结果hUCMSCs外泌体高表达CD9、CD81，可明显抑制CD4+T和CD8+T细胞的增殖，升高CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞比例，经CD3CD28单抗刺激后CD45+CD4+Ki67+和CD45+CD8+Ki67+细胞比例为85356和726土63，同时升高PBMC分泌的TGF一131水平，降低IFN一1、IL-6、TNF-Ot的水平(均P95)，不表达CD34、CD45、HLADR(1)。使用BCA法定量外泌体总蛋白，测得样品蛋
3、白浓度约为(3700-4-125)恤gml。每106个hUCMSCs的细胞上清液中平均能提取约72斗g外泌体。蛋白质免疫印迹法检测结果显示，hUCMSCsex表达CD9、CD8 1蛋白(图1)。2hUCMSCsex对PBMC体外增殖能力的影响：以Ki-67测定细胞增殖能力。结果发现，经CD3CD28单抗刺激后CD45+CD4+Ki67+和CD45+CD8+Ki67+细胞比例为85356和万方数据生垡匡堂苤查垫!笙!旦堑旦复!i鲞筮!翅盟堕!丛塑鱼!i坚：垒!趔塾!：垫!：!丛：!：盟!：丝72663，MSCs(10：1)可明显抑制CD45+CIM+和CIM5+CD8+细胞的增殖，而不同浓度的h
4、UCMSCsex(1，5和10斗g106 PBMC)同样可明显抑制CD45+CD4+和CD45+CD8+细胞的增殖，呈浓度依赖性(图2)。样本1 样本2 相对分子质量25 000口匾三二三国z。ooo图1 hUCMSCsex表达CD9、C1)8l蛋白100主 80i 60嚣to磬 200暗暗1 2 3 4 5CD45+CD4+Ki67+()l 2 3 4 5CD45+CD8+Ki67+()注：1：PBMCst组；2：PBMCst+MSCCX l；3：PBMCst+IVISCex 5：4：PBMCst+MSCex 10；5：PBMCst+MSC(10：1)图2 hUC-MSCsex对PBMC体外
5、增殖能力的影响与PBMCst组比较，8P0053hlJCMSCsex对PBMC中CD4+CD25+FoxP3+TCD3+CD8一ILl7A+T细胞比例的影响：MSC分泌的exosome8同MSCs一样，可诱导CD4+CD25+FoxP3+T细胞比例的升高，对CD3+CD8一ILl7A+T细胞的比例影响不明显(图3)。流式统计D104幽103凸_I 102=皇101100 101 102 103 104CD8 FITCc 104103山壹102藿10，100F104103山占102譬已101100柱状图也显示PBMC+MSCex 5-Treg(7115)，PBMC+MSCeX 10一Treg(8
6、220)，PBMC+MSC(10：1)一Treg(6813)，与PBMC组(4915)比较，差异有统计学意义，均P005。4hUCMSCsex对PBMC分泌细胞因子的影响：hgCMSCsex能降低CD3CD28单抗刺激后的PBMC产生IFN一儿TNF仪、IL-6，而增加TGFp1的表达(图4)。1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4IFN_Y TNFa IL一6 TGFD1注：l：PBMC组；2：PBMCst组；3：PBMC-st+MSCeX 10组；4：PBMCst+MSC(10：1)图4 hlJC-MSCsex对PBMC分泌细胞因子的影响 与PBMCst组比较，8P
7、O05讨 论间充质干细胞是一种具有高度自我更新能力与多向分化潜能的多能干细胞，目前已应用于临床治疗自身免疫性疾病、心肌损伤性疾病、神经损伤性疾病等，然而其治疗机制尚不明确。现已明确，hUCMSCs具有免疫调节功能，可以抑制T、B、NK等细胞的增殖，调节Treg，Ih17，1型和2型巨噬细胞等的平衡。既往的研究也发现，这种调节作用可由细胞、 2， ，、：t司一 _，101 102 10a 10CD25一PC5101 102 1 03 10CD8 FITC图3流式细胞仪检测结果 hUCMSCseX对PBMC中CIN+CD25+FonD3+TCD3+CD8一ILl7A+T细胞比例的影响AF：为代表性
8、的流式图。A：PBMCTreg，B：PBMC+MSCeX 10-Treg，C：PBMC+MSC(10：1)一Treg，D：PBMC-Thl7，E：PBMC+MSCex 10一Thl7，F：PBMC-PBMC+MSC(10：1)Treg细胞直接接触或间接通过释放免疫抑制因子所介导，如TGFB1、PGE2、IDO、IL一10等。近年研究发现MSCs分泌的外泌体亦参与细胞间的信息交流，可能是其发挥治疗作用的重要机制之一，也已证实MSCs分泌的exosome8能够有效减少心肌损伤范围、保护急性肾小管损伤、促进神经再生、减轻肺损伤引。因此，本研究是为了探索hUCMSCs分泌的exosomes是否也具有免
9、疫调节功能。近年来研究发现，MSCs具有强大的免疫调节功能，其高表达IL一17受体，并通过分泌大量的细喜|咖喜o3221l万方数据虫堡匡堂苤壹!Q!i笙!旦垄旦箜堕鲞筮丝塑盟堂丛盟鱼!i坠：墅艘塾箜：垫!：y!l：堕。丛!：丝胞因子调节Treg和r11117细胞的增殖和分化一1。给小鼠输注BMMSCs可抑制Thl7细胞的激活和迁徙，有效抑制Thl7细胞分泌的细胞因子IL一17和IL一22的产生，促进Thl7细胞向IL一10+FoxP3+Treg细胞分化J。Blazquez等2 o发现脂肪来源的MSCs的外泌体能够调节T细胞的数量及功能。我们的结果也提示，hUCMSCs分泌的exosomes可在
10、体外明显抑制CIM+T和CD8+T细胞增殖。提示，hUCMSCs分泌的exosomes可介导细胞的免疫抑制作用。迸一步分析MSCs分泌的exosomes对T细胞亚群分化的影响，结果发现，MSCs分泌的exosomes可明显诱导CIM+CD25+FoxP3+Treg细胞比例的升高，这可能与exosomes上调Treg细胞分化的关键细胞因子TGFB1的水平有关3|。既往研究已发现MSCs及MSCs分泌的外泌体均可抑制淋巴细胞产生和分泌的促炎细胞因子2I，我们实验结果也证实hUCMSCs分泌的外泌体能抑制PBMC其产生IFN1、IL-6、TNF一0l，并且外泌体的抑制作用更加明显。提示hUCMSCs
11、分泌的外泌体有望在炎症、自身免疫异常疾病治疗中发挥治疗作用。越来越多的发现也逐步认识到，MSCs分泌的外泌体可能是MSCs发挥治疗作用的重要机制之一，它可以通过与靶细胞的胞膜直接融合，释放mRNA、miRNA进入细胞质，或是通过内吞作用被靶细胞摄取以及识别细胞表面的特异性受体等方式调节疾病异常微环境，逆转疾病的发生发展4|。这些发挥特定作用的分子及其在MSC分泌的外泌体免疫调节中的作用尚需进一步鉴定和研究。总之，我们的研究发现，hUCMSCs分泌的外泌体具有免疫调节功能。较之MSCs的直接输注，外泌体的应用更为安全，更为高效，可望成为未来细胞治疗的新手段，更好发挥MSCs的临床治疗价值。参考文
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19、医学实验动物管理实施细则，本刊对论文中有关实验动物的描述，要求写清楚以下事项：(1)品种、品系及亚系的确切名称；(2)遗传背景或其来源；(3)微生物检测状况；(4)性别、年龄、体重；(5)质量等级及合格证书编号；(6)饲养环境和实验环境；(7)健康状况；读者作者编者(8)对动物实验的处理方式。医学实验动物分为四级：一级为普通级；二级为清洁级；三级为无特定病原体(SPF)级；四级为无菌级(包括悉生动物)。卫生部级课题及研究生毕业论文等科研实验必须应用二级以上的实验动物。万方数据人脐带间充质干细胞外泌体免疫调节功能的研究作者： 刘明， 汪劲松， 刘沐芸， 胡祥， 徐军， Liu Ming， Wan
20、g Jinsong， Liu Muyun， Hu Xiang， XuJun作者单位： 刘明,徐军,Liu Ming,Xu Jun(510120 广州,呼吸疾病国家重点实验室,广州呼吸疾病研究所,广州医科大学附属第一医院)， 汪劲松,刘沐芸,胡祥,Wang Jinsong,Liu Muyun,Hu Xiang(深圳市北科生物科技有限公司)刊名： 中华医学杂志英文刊名： National Medical Journal of China年，卷(期)： 2015,95(32)引用本文格式：刘明.汪劲松.刘沐芸.胡祥.徐军.Liu Ming.Wang Jinsong.Liu Muyun.Hu Xiang.Xu Jun 人脐带间充质干细胞外泌体免疫调节功能的研究期刊论文-中华医学杂志 2015(32)
