1、1三叶草基因工程研究进展摘要 三叶草作为优良的牧草，具有营养丰富、品质优良、适口性好等特点。现代生物技术的不断发展为三叶草育种和种质创新提供了新的技术手段，笔者从三叶草再生和遗传转化体系，转基因三叶草在品质改良、抗病性、抗虫性、抗逆性及作为植物反应器等方面的研究进展进行了全面综述，分析了三叶草基因工程研究中存在的主要问题，并对其应用前景和研究方向进行了展望。关键词 三叶草 再生体系 转化体系 转基因中图分类号 前言 三叶草属，也称车轴草属，全球约 250 余种，原产亚洲南部和欧洲东南部。野生种分布于温带及亚热带地区，为栽培历史较悠久的牧草之一，现已遍布世界各国，其中栽培面积最大的是西欧、北美、
2、大洋洲和原苏联地区。三叶草主要用作反刍动物的饲草饲料。是一种世界性分布与栽培的优良豆科牧草。该属在农业上有经济价值的有 25 种，其中最重要的约 10 种。我国是世界上第 2 草地大国，三叶草在我国广泛种植，常见的野生种有白三叶、红三叶、草莓三叶草和野火球 4 种；引自国外的有杂三叶、绛三叶、地三叶和埃及三叶 4 种；目前栽培研究较多的是白三叶、红三叶及地三叶 1。三叶草具有生态适宜性强、侵占性强、耐践踏、利用年限长、营养丰富、产量高、耐粗放栽培管理、抗病虫危害和种植利用成本费用低等优点。作为我国最重要的豆科牧草之一,三叶草不仅是重要的饲料作物,还在土壤改良、水土保持以及生态环境保护方面发挥着
3、积极的作用。但是,三叶草缺乏含硫氨基酸、较不耐旱、抗虫性差、易感染苜蓿花叶病毒等问题,常规育种难以解决,通过基因工程方法将目的基因导入三叶草是改良三叶草品质,增强其抗病、抗虫、抗逆能力的有效手段.近年来随着植物基因工程研究的进展,越来越多的转基因成功的报道也不断出现。三叶草通过生物技术研究,可实现高蛋白基因、固氮基因、病虫害基因及抗逆性基因等转移,培育造福人类的牧草新品种，而必将会极大地促进畜牧业发展，促进地被覆盖和生态建设，对当地人民生活水平和生活环境的提高和改善具有重要的实践意义。尤其是随着人们生活水平的改善，对绿色蛋白质饲料和绿色畜产品需求也日益增加。通过基因工程技术培育出各种优质高产的
4、牧草新品种，对促进无污染绿色养殖业和绿色畜产品的发展，以及我国西部地区生态环境建设都会产生深远的影响。 1 三叶草再生体系的建立三叶草再生体系的研究最早开始于 20 世纪 70 年代末 1979 年报道了关于红三叶草的组培研究，红三叶草的组织培养再生率只有 1%甚至更小，再生率极低。试验结果表明 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）不利于红三叶愈伤组织的诱导,但加入 P-氯苯氧乙酸或其他生长素能增强 2,4-D 的作用。利用红三叶草的子叶胚轴诱导愈伤组织进行组织培养研究 也获得很低的再生率。红三叶下胚轴诱导愈伤组织起重要作用。1982 年美国研究人员成功地从愈伤途径和生长点直接再生途径得到了红三
5、叶草的再生植株。1983 年从白三叶的原生质体得到了白三叶的再生植株。1988 年对红三叶草组织培养进行了研究，同样也得出了红三叶草再2生率低的结论，并推断红三叶草的再生能力受到遗传机制的控制。1989 年以 24个白三叶品种为材料研究其再生，从瑞典品种“Undrom”得到了再生率较高的白三叶植株。1989 年从红三叶草的叶柄诱导愈伤组织得到的植株再生率达到 81%。而后红三叶草再生技术进行研究，在他们的研究中发现，整个植株群体中约有4%的植株的再生率比较高，然后在这 4%再生率高的植株中再进一步筛选和再生，结果显示植株的再生率提高 愈伤组织诱导的再生植株具有高度遗传特性。1994 年用原生质
6、体培养得到了红三叶草的再生植株，为三叶草再生开辟了一条新途径。国内三叶草的组织再生有少量报道。1994 年孟玉玲等 2报道了利用下胚轴在 MS 培养基上直接再生植株的方法,利用红三叶下胚轴切段培养在40d 就可得具有发达根系的再生苗,再生率达 27%而通过愈伤组织分化苗,时间长且再生率也较低,为 8%10%。2002 年杨丽莉等 3报道了白三叶植株再生系统中不同外植体的再生能力和不同激素影响的研究，结果发现不同外植体的再生能力差异极大。白三叶草生长点的分生细胞具有很强的分化能力。而子叶分化率极低，大约为 1%4% ，下胚轴下段几乎不分化，研究还显示 6 苄基氨基嘌呤（6-BA）在 3mg/L
7、时植株再生频率最高。再生白三叶快繁的激素浓度在 6-BA 1-2mg/L，萘乙酸 0.5-0.8mg/L 较适宜,而吲哚丁酸浓度在 0.1-0.3mg/L 内有利于生根培养。2004 年对红三叶草的组织再生进行了优化,证明 L2 培养基更适合三叶草的培养。2 三叶草遗传转化的研究进展随着生物技术的发展，转基因技术已成为牧草和作物遗传改良的有效途径。迄今，在豆科牧草的遗传转化体系研究中，以苜蓿研究的较多，三叶草遗传转化的研究也有大量报道。20 世纪 80 年代后期国外开始对三叶草的转化体系进行探讨。1987 年首次将白三叶品种 WR8 的匍匐茎用含有双元载体的农杆菌进行了转化，用卡那霉素做选择标
8、记获得了转化体,这一方法后来被成功用于白三叶外源基因的导入,但是转化率较低,而且组培时间较长。后来又对其进行了改进，即用萌发 3d 的种子直接作转化受体，新霉素磷酸转移酶基因作选择标记，通过农杆菌介导对 2 个白三叶草品种进行了遗传转化。1994 年用农杆菌介导法转化地三叶获得成功，并通过验证，1996 年用吸胀的成熟种子作转化受体，bar 基因作选择标记，通过农杆菌对品种进行了转化获得成功。1998 年通过对葡萄糖苷酶基因表达情况的研究。分析了 F2 代转基因白三叶的遗传稳定性，认为 F2代纯和体和杂合体的 GUS 表达没有明显区别。2003 年以红三叶草子叶为转化体,用农杆菌介导法将外源的
9、苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因(AMV)转入红三叶草转基因植株.2007 年谷俊涛等 4以白三叶草品系为遗传转化的外植体供源,利用子叶下胚轴为外植体,建立了白三叶草高效遗传转化及转基因植株高频率再生体系。研究发现采用种子胚轴等外植体直接诱导植株再生存在着不同物种间的差异，相同物种的不同基因型之间诱导植株再生的能力也不相同。此外在适宜的遗传转化和植株再生的条件下，外植体在选择培养基上诱导的芽数和植株再生的数量很高，诱导的芽率和外植体再生植株率可分别达到 70.37%和 62.12%。2007 年何穗华等 5以红三叶草分生组织直接再生并产生少量愈伤的基础上，以红三叶草品种“Altaswede”作为受体材
10、料，以GUS 基因为报告基因，研究了影响农杆菌转化效率的主要因素及对提高红三叶草转化效率的影响，从而建立了农杆菌介导的红三叶草快速高效遗传转化体系，3试验研究了遗传转化过程中菌液浓度、共培养时间、侵染方法等因素对转化效率的影响。结果表明，以红三叶草上胚轴为外植体，经农杆菌菌液侵染 20min真空处理 9min，共培养 5d 后转入分化培养基中，4 周后 60%的外植体分化出不定芽并生根成苗。抗性苗经聚合酶链式反应（PCR）分子检测,阳性率为80%，最终转化率约为 50%，远高于国内外报道的转化率水平。3 三叶草转基因研究3.1 品质改良牧草品质包括很多方面，但主要是牧草的营养品质。它不仅直接决
11、定着家畜的生长和发育，也间接影响着畜牧产品的质量和数量。豆科牧草作为饲料普遍存在的问题是缺少甲硫氨酸和半胱氨酸的含硫氨基酸 试验证明添加这些含硫氨基酸的饲料对增加毛的产量和牲畜的生长具有重要的作用。目前，三叶草品质改良的研究主要集中在关于增加其含硫氨基酸含量和有机磷利用的研究。磷元素是豆科牧草主要营养元素，我国缺磷面积广大，磷元素的缺乏将直接导致三叶草严重减产。同时，在混播草地中的三叶草稳定性也会随之降低。生物技术为牧草的遗传改良提供了新的手段。研究表明，通过转基因可改变三叶草中磷的转运功能或调解根系结构以增加对磷的吸收利用。2002 年在地三叶中表达了从黑曲霉中得到的植酸酶（phyA）基因，
12、phyA 的表达可以使植物有效地利用土壤中的有机磷，研究分析表明，在提供有机磷但营养匮乏的培养基里。转 phyA 基因的地三叶草能较好地吸收利用其中的磷元素。2007 年韩胜芳等 6通过农杆菌介导法建立了高效表达黑曲霉 phyA 基因的白三叶草遗传转化体系，在植酸盐为唯一磷供源条件下，转基因系 3 的植株较对照（CK）含磷量增加34.88%磷累积量增加 2.54 倍，鲜重增加,1.79 倍，干重增加,1.62 倍，表明由patatin 信号肽引导下超量表达黑曲霉 phyA 基因能显著增强白三叶草利用有机态磷的能力。以上研究表明在三叶草中超量表达 phyA 基因，对于改善三叶草在土壤中高比例有机
13、态磷植酸盐的利用，提高植株磷素营养，从而使有机态磷分解为易于被利用的有效态磷，可能是增强三叶草抵御磷胁迫逆境的一条有效途径。3.2 抗生物与非生物逆境 3.2.1 抗真菌 真菌是造成红三叶等三叶草减产的主要病害，真菌侵入三叶草的根和叶，导致三叶草品质下降、抗性减弱，产量减少，在澳大利亚真菌病害大发生的年份会造成三叶草 47%的减产。通过转基因技术培育牧草抗病品种已开展了一些工作，2010 年利用器官特异和病原诱导启动子调控抗真菌病 AFRs基因，成功地将该基因转入白三叶草中，但其抗病性是否提高还未被证明 后期试验正在进行中。 3.2.2 抗病毒病 苜蓿花叶病和白三叶花叶病等各类病害给三叶草生产
14、带来了巨大损失，我国苜蓿花叶病毒的发病普遍，各地苜蓿、三叶草等豆科植物种植面积较大，为其发生提供了广泛的寄主，并以此为接种源通过蚜虫或其他途径传播而使一些对苜蓿花叶病毒（AMV）敏感的作物发病，暂时还没有安全有效的防治方法，研究人员希望通过基因工程育种，获得抗病毒转基因植株，提高其对各种病毒的抵抗力来减少损失。将 AMV、白三叶花叶病和三叶草黄斑病的外壳蛋白基因分别转入三叶草 转基因植株抗病性明显提高 7。2004 年转化得4到了 1300 株转 AMV 基因的白三叶草，通过定量 PCR 和农艺性状分析筛选出优良植株，在世界上首次用于抗 AMV 的转基因白三叶草生产。赵贵琴等 8用农杆菌介导法
15、将苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因转化白三叶草和红三叶草,对这些植株进行 PCR、Southern 印迹杂交和 Northern 杂交分析，结果表明，外源目的基因已经整合到三叶草基因组中并且得到了表达，对 Northern 分析呈阳性的植株进行了抗病性检测，结果表明，表达苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因的植株病症减轻，发病率、病情指数及病毒积累量都明显低于对照，有的甚至不表现症状，达到了基本免疫的程度。 3.2.3 抗虫 在三叶草生产中，虫害也是影响其产量的主要因素之一。随着基因工程技术的迅猛发展，为培育三叶草抗虫品种提供了新的手段。目前，三叶草抗虫基因工程主要集中在现已分离出与抗虫相关的基因。如苏云云金杆菌
16、分泌的杀虫晶体蛋白（Bt）基因和蛋白酶抑制剂（P1 ）基因。将 Bt 和蛋白酶抑制剂(PIs)转入白三叶草,检测到 Bt 蛋白在转基因植株叶中积累为 0.1%，PIs 积累为0.07%；将获得的转基因植株饲喂幼虫，结果表明转基因植株对其有较强的抗性。将大豆胰岛素抑制蛋白基因（SBTI）导入白三叶草 ,验证了大豆胰岛素抑制蛋白在三叶草叶片中的积累，并证明了其表达可使三叶草有很好的抗虫效果。目前国内还无相关研究的报道。3.2.4 抗逆 目前，抗逆基因工程主要集中在逆境条件下表达的某些基因和抗逆代谢过程中某些酶的研究。甜菜碱在多种生物里起着维持细胞正常膨压和无毒渗透保护剂的作用，它的积累使得许多代谢
17、中的重要酶类在渗透胁迫下依然能够保持生理活性 从而使细胞的耐盐和耐旱水平得到提高。2004 年陈传芳等 9将甜菜碱醛脱氢酶基因成功地转化了白三叶草 转基因植株能够在含有 0.5% NaCI 的水培养中正常生长 2 周以上,而非转基因植株则不正常生长，表明BADH 基因已使转基因白三叶草的耐盐能力有一定程度的增强。磷脂酶是植物中广泛存在的一种酶,在自然状态下，当植物受到逆境如病虫害、干旱、水淹、盐害、寒冷和高温等胁迫时，磷脂酶活性会在短时间内急剧变化，使膜的透性改变，从而引起植物的应答反应或伤害。如果能在一定范围内抑制 PLD 的活性,则有可能改变植物对逆境的反应,减少伤害。2005 年赵志文等
18、 10利用农杆菌侵染组培苗的幼芽导入了转反义磷脂酶 D 基因，经 PCR 和 Southern 杂交检测，证实 PLD 基因已整合入白三叶草基因组中，但无抗逆试验数据。3.3 植物疫苗利用转基因植物表达抗原蛋白.进行可食用疫苗研究是基因工程研究的热点之一，有着良好的发展前景。三叶草是优良的豆科牧草，蛋白质含量高，是作为生物反应器生产可饲用疫苗良好的受体。牛巴氏杆菌病是牛的一种急性传染病，当牛遭遇风寒、过度疲劳和饥饿等不良因素刺激使机体抵抗力降低时，该菌经淋巴液进入血液引起败血症。Lee 等将曼氏溶血杆菌 AlLkt 基因转入白三叶，激光共焦显微镜和 Western 杂交检测证实了白细胞毒素 5
19、0 与绿色荧光蛋白的融合基因(Lkt50-GFP)的表达,并用提出物注射兔子，诱导兔子产生了免疫反应，证明 Lkt50-GFP 蛋白具有免疫原性。 2003 年他们又通过田间试验验证蛋白的稳定性，证明了 Lkt50-GFP 基因在田间与实验室有着相同的表达效果，而且 1 年之后仍能检测到抗原的存在。张占路等 11-12将 H5N1 禽流感血凝素基因按豆科植物密码子进行改造，通过农杆菌介导法转入红三叶，用 PCR、RT-PCR 检测，Westernbiot 结果表明，禽流感血凝素基因已经在红三叶草中表达。禽流感免疫5饲料初步动物试验数据表明，试验组鸽精神状况良好，种鸽返蛋日期提前；试验组比对照组
20、血清禽流感抗体阳性率有提高，平均滴度也有升幅，鸽血清中产生禽流感抗体的概率增多，由 30%提高到 54%。目前后期试验还在进行中。4 存在的问题及对策与传统育种方式相比，转基因技术具有育种周期短，效率高等优点 13-14。虽然三叶草基因工程取得了巨大的进展，但仍存在着许多问题。主要表现在：1）转化方法单一，再生体系的构建和遗传转化还不太完善。三叶草遗传转化主要采用农杆菌介导法，外源基因通常是随机整合到植物的基因组中，外源基因的表达就会很难预测 转基因植株可能会出现基因沉默的现象，转基因植株正常生长发育可能会受到影响。因此，在今后的研究中应探讨影响三叶草遗传转化效率的各种因素，加大三叶草高频再生
21、体系与适宜转化方法的研究和完善，建立起高效、稳定的遗传转化体系，提高三叶草的转化效率。 2）目的基因的表达强度不够。目前，各种目的基因在三叶草内的表达量还比较低，难以达到理想的效果，至今还没有转基因三叶草新品种商业化的报道。以后应从选择特异表达或诱导型的启动子、利用引导肽进行表达产物的定位及建立位点特异的重组体系等方面加以改进，以尽可能地提高目的基因在转基因三叶草中的表达量。3）缺乏有重要应用价值的目的基因。与产量、品质等相关的外源目的基因的分离及转化尚处于起步阶段，所应用的外源基因很少来自三叶草基因组本身。今后应除加强转基因本身的研究外，还应加快三叶草新基因鉴定和分离克隆方面的研究，给转基因
22、提供有应用价值的目的基因。特别是现阶段我国可供利用的拥有知识产权的基因还不多，需要与分子生物学科技工作者协作攻关。5 展望近年来，生命科学和生物技术不断取得重大突破，正在成为新科技革命的重要推动力。生物经济将在提高人民健康水平、保障粮食安全、缓解能源压力、改善生态环境等方面发挥着重要的、不可替代的作用。就三叶草而言 随着我国养殖业和城镇绿化的迅速发展。为转基因三叶草提供了广阔的应用前景，基于三叶草在生物学上的意义和经济价值，以它为试验材料的基因工程研究必将不断深入开展。虽然我国的三叶草转基因研究已经取得一些成就，但仍与澳大利亚，新西兰等国家有一定的差距。因此，在已有三叶草研究的基础上，应继续对
23、三叶草遗传转化体系、抗虫、抗病、抗逆、生物反应器、提高附加值以及突破育种技术手段等方面开展广泛深入的研究，不断提升我国转基因三叶草研究的整体水平。近期应针对我国三叶草生产和科研的实际，重点开展 4 个方面的研究工作：1)对我国野生三叶草资源进行搜集、整理和遗传多样性分析;2)转基因红三叶草的抗病性研究3)转基因白三叶草的抗寒、抗旱性研究4)转基因三叶草高表达抗原蛋白的研究最终通过基因工程技术对三叶草不同的优良性状加以聚合.获得较高蛋白质含量.特别是含硫氨基酸和抗原蛋白；丰富的碳水化合物；含一定量的单宁；易撕裂的表皮；足以维持动物所需的矿物质；对 AMV、WCMV 和 CYVV 较高的抗性；有较
24、强的抗虫和抗逆性的三叶草新品种，以促进我国草业的发展，造福于6人类。参考文献【1】陈宝书，牧草饲料作物栽培学M北京；中国农业出版社， 2001.224-233【2】孟玉玲，皓云鹏，贾静芬，红三叶组织培养及植株再生J。草业学报，1994.3（2） ；51-54【3】杨丽莉，贾炜珑，张彦芹，白三叶草高频率植株再生系统的研究J。山西农业科学。2002,30（3） ；70-72【4】谷俊涛，赵红梅，刘祝玲，等。农杆菌介导白三叶草高效遗传转化和转基因植株再生J。草业学报。2007,16（2） ；84-89. 【5】何穗华，张占路，吴燕民，等。农杆菌介导红三叶草遗传转化体系的建立J。中国草地学报。2007
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