1、下一代测序技术：技术回顾与展望2010-02-11 09:15:28 来源：易生物实验 浏览次数：4203 网友评论 0 条 DNA 测序技术的数据产出能力呈指数增长, 而且这一技术本身也演变成为一个面向工程学和物理学的新技术领域. 本文分析了下一代测序仪的技术特点, 并对其未来的发展以及应用进行了前瞻性的展望. 关键词：测序 DNA 测序 DNAsequencing周晓光*, 任鲁风, 李运涛, 张猛, 俞育德, 于军 * 中国科学院北京基因组研究所, 基因组科学与信息重点实验室, 北京 100029; 中国科学院半导体研究所, 北京 100083* 联系人, E-mail: ; 摘要 在过
2、去的 30 年中, 作为最重要的生物医学研究手段之一, DNA 测序技术的数据产出能力呈指数增长, 而且这一技术本身也演变成为一个面向工程学和物理学的新技术领域. 本文分析了下一代测序仪的技术特点, 并对其未来的发展以及应用进行了前瞻性的展望. 预期在刚刚出现的技术中, 有些技术假以时日能够发展成熟, 实现 1000 美元基因组和 100 美元基因组的目标. 同时建议中国科学家在这场对科学研究以及社会医疗保健体系都将产生深远影响的运动中发挥积极的作用. 关键词：基因组学、DNA 测序、下一代测序技术、测序仪DNA 测序技术自发明以来就一直在推动分子生物学发展方面起着至关重要的作用 1 . 从早
3、期 Frederick Sanger 的手工测序, 以及基于 Sanger 法开发的第 1 代自动化测序仪, 到目前的下一代测序平台, 这一领域已经发生了巨大的变化2. 有人甚至将基因组测序技术的发展与半导体技术的发展相提并论, 这也不无道理3在过去的数十年中, 每经过几年, 测序速度就呈指数增长 , 与半导体工业发展的摩尔定律 (Moores law)非常相似4. 这种高速的发展, 如图 1 所示, 从根本上改变了人们研究所有生命蓝图的方式. 并且推动了基因组学及其分支乃至其他密切相关学科的创立与发展, 诸如比较基因组学、生物信息学、系统生物学以及合成生物学. 某种程度上, DNA 测序技术
4、的进展已经使生命研究的基本元素发生了转变从单一、局部的基因或基因的片段转变成整个基因组. 反过来, 这种转变又需要更加强大的测序技术来支持. 测序技术与其应用之间的协同关系使得两者的发展在可预见的未来内保持这种趋势, 并且由于其对个体化疾病诊断与治疗具有确定性的推动作用而加速. 本文回顾了测序技术的演进 , 分析几代测序技术的优点与缺点 . 并对这一领域可能的发展方向做出了预测. 为便于讨论, 根据技术的进展 , 将测序技术分为具有不同亚代的 3 代(表 1). 尽管根据技术进展将其划为不同世代有些武断, 但是这种方法还是能够体现每个阶段的关键技术进展. 图 1 测序技术发展时间轴1 技术回顾
5、与近期发展1.1 第 1 代测序技术 荧光标记的 Sanger 法在第一台全自动测序仪出现之前, 使用最为广泛的测序方法就是 Sanger 在 20 世纪 70 年代中期发明的末端终止法测序技术. Sanger 也因此获得 1980 年的诺贝尔化学奖5. 他的发明第一次为科研人员开启了深入研究生命遗传密码的大门. 原来的方法主要依靠手工操作, 难以自动化. 例如, 它利用放射性同位素标记引物来进行 DNA 梯状成像, 操作十分不方便 . 要使用双脱氧核苷酸分别做 4 个末端终止反应, 然后采用平板凝胶电泳技术, 用 4 条电泳道来分离 4 个反应所得产物, 费时费力, 试剂消耗也大, 这些都严
6、重限制了测序的通量. 因此, 对于开发非放射性的第一代测序技术势在必行 . 1) G1.1. 最早版本的第 1 代测序仪是 20 世纪 80 年代中期在 Cal Tech 的 Leroy Hood 实验室发明的6. 这一测序仪通过修改 Sanger 法得以实现 . 最关键的改变是采用具有颜色的荧光染料代替同位素标记. 4 种双脱氧核苷酸终止子被标记上不同颜色的荧光基团. 另外, 与最初的 Sanger 法不同, 荧光基团是标记在终止子上, 而不是在引物上. 这种不同颜色标记的方案可以实现一个反应管中同时进行 4 个末端终止反应. 采用聚丙烯酰胺凝胶分离, 并通过计算机荧光检测系统分析梯状反应产
7、物. 这些改进极大地提高了测序速度, 减少了测序过程中的人为干扰. 次年, 利用 Leroy Hood 实验室的技术 , ABI 推出了第一款半自动 DNA 测序仪 ABI 3707. 在随后的 20 年中, 测序仪的性能得到了极大的提升 . 但基本工作原理直到最近才有所改变. (2) G1.2. 第 1 代测序仪的第 2 个版本出现在 20 世纪末. 这一版本的测序仪, 其测序速度与质量得到了进一步的提高. 这主要归功于两方面的工作 : 第一, 平板电泳分离技术被毛细管电泳所取代; 第二, 通过更高程度的并行化使得同时进行测序的样本数量增加. 使用毛细管替代平板凝胶取消了手工上样, 降低了试
8、剂的消耗, 提升了分析的速度. 另外, 紧凑的毛细管电泳设备的形式更易于实现并行化, 可以获得更高的通量 . ABI 3730 测序仪和Amersham Mega- BACE 分别可以在一次运行中分析 96 个或 384 个样本. 这一代测序仪在人类基因组计划 DNA 测序的后期阶段起到了关键的作用, 加速了人类基因组计划的完成. 而且由于其在原始数据质量以及序列读长方面具有的优势, 这些测序仪今天还在使用之中. 通过几十年的逐步改进, 第 1 代测序仪的读长可以超过 1000 bp, 原始数据的准确率可以高达 99.999%, 测定每千碱基序列的成本是 0.5 美元, 每天的数据通量可以达到
9、 600000 碱基. 不论这些数字如何令人印象深刻, 第 1 代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限. 由于其对电泳分离技术的依赖, 使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度, 并且难以通过微型化降低测序成本. 因此, 需要开发全新的技术来突破这些局限 . 尽管如此, 第 1 代技术是不会很快消失 , 它将与新的若干代测序平台并存. 这些久经考验的方法可靠、准确, 且已形成规模化 , 特别是在 PCR 产物测序、质粒和细菌人工染色体的末端测序、以及 STR 基因分型方面, 将继续发挥重要作用. 1.2 第 2 代测序技术 循环阵列合成测序法 所谓下一代测序方法, 包括大量基于不同技术的
10、方法. 尽管从模板文库制备、片段扩增到测序, 这些方法所采用的技术与生物化学相当多样, 但是都采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术阵列上的 DNA 样本可以被同时并行分析. 此外, 测序是利用 DNA 聚合酶8或连接酶9以及引物对模板进行一系列的延伸 , 通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号实现的. 在一般性描述中, 下一代测序技术的几个关键特点是显而易见的 : 第一, 通过有序或者无序的阵列配置可以实现大规模的并行化, 以提供高程度的信息密度 . 理论上, 只有光的衍射极限会限制并行化的提高(即用来检测独立光学事件的半波长). 这极大地提高了总的测序数据产出通量; 第二, 不采用电
11、泳, 设备易于微型化. 相对于第 1 代测序技术, 样本和试剂的消耗量得以降低. (1) G2.1下一代测序仪. 所有的下一代测序平台遵循了类似的工作流程, 如图 2 所示, 都要经过克隆扩增以加强测序过程中的光学检测灵敏度. 3 种广泛使用的商业化平台是Illumina 的 Genome Analyzer, 罗氏 454 基因组测序仪以及 AB Life Technologies 的 SOLiD 系统. 它们基本都是在 20 世纪 90 年代末被发明和开发出来 , 在 2005 年前后商业化. Polonator G.007 是最近刚刚实现商业化的新设备, 该仪器最初由哈佛大学 George
12、 Church 实验室开发, 现在由 Dover Systems 公司制造. Complete Genomics 公司最近推出了基于其专利技术的测序服务平台, 但该公司并没有表示要在市场销售这一设备. 这些仪器都采用了合成测序法, 只是在 DNA 阵列的排布、DNA 簇扩增, 以及基于酶的测序生化反应方面存在差异.图 2 第 2 代测序技术工作流程首先, 构建 DNA 模板文库. 通过随机打断基因组 DNA 获得 DNA 文库片段(长度为数十到数百碱基), 或者构建控制距离分布的配对末端片段. 在双链片段的两端连上接头序列, 然后变性得到单链模板文库, 并固定在固体表面上. 固体表面可以是平面
13、或是微球的表面. 克隆的扩增通过以下几种方式之一进行, 如桥式 PCR10、微乳滴 PCR11或原位成簇12. 在芯片上形成 DNA 簇阵列的 DNA 簇或扩增微球, 利用聚合酶或者连接酶进行一系列循环的反应操作, 通过显微检测系统监控每个循环生化反应中产生的光学事件, 用 CCD 相机将图像采集并记录下来. 对产生的阵列图像进行时序分析 , 获得 DNA 片段的序列. 然后按照一定的计算机算法将这些片段组装成更长的重叠群. (i) Illumina Genome Analyzer. 单链文库片段的扩增是通过所谓“桥式扩增”过程实现的13. 单链 DNA 两端加上非对称的接头, 并利用两端的接
14、头将片段固定在芯片表面形成寡核苷酸桥. 芯片具有 8 个独立的道 , 每条道的表面均可固定寡核苷酸. 固定了寡核苷酸桥的芯片放置于流通池内. 经过多个 PCR 热循环, 成千上万的复制产物制备出来 , 每一簇都分别固定在芯片表面一个单一的物理位置上. 流通池中芯片表面的 8 个道中, 每条道上都可以独立产生数百万这样的簇(这样 , 可以在一个反应中对 8 个不同的文库并行测序). 然后, 测序引物杂交到扩增产物中的通用序列上, 开始测序反应. Illumina 公司的测序仪采用合成测序法 , 使用荧光标记的核苷酸以及可逆的终止子 . 在每一轮测序循环中, 标记不同荧光基团的 4 种核苷酸以及
15、DNA 聚合酶同时加入流通池通道中, 按照碱基互补配对的原则进行 DNA 链的延伸. 每个核苷酸的 3羟基是被封闭起来, 以防止额外的延伸. 采集荧光图像, 碱基特异的荧光标记揭示了这一轮中新加入核苷酸是什么, 也就获得模板中这一位置的 DNA 序列. 然后, 打开 3端, 继续进行下一轮反应. 这一过程重复多次, 到 50 个循环, 产生 50 个碱基的 DNA 序列. 该平台的测序通量是传统平台(第 1 代测序仪) 的数千倍. 其主要的缺点是由于光信号衰减和移相的原因使得序列读长较短. 由于要记录每个 DNA 簇的光学信号, 每一簇中所有DNA 链的延伸保持同步至关重要. 但是, 测序中每一步化学反应都可能失败, 例如不能将荧光标记物切掉, 或者未能去除封闭基团 . 这将导致一个簇中的一些 DNA 链过长, 而另一些 DNA 链可能没有同步延伸, 进而引起信号衰减或荧光信号相位移. 此外, 错误率是累积的, 即 DNA 链越长, 错误率越高 . 这些都限制了读长的增加 .
