1、分光光度分析法 Spectrophotometry,一、实验目的,1、了解分光光度法的基本原理，理解何谓吸收曲线。 2、掌握朗伯比尔定律，理解何谓标准（工作）曲线。 3、了解显色反应及其影响因素，了解测量条件的选择。掌握光度法测定的条件及方案的拟定方法。 4、了解分光光度计的性能、结构及使用方法；,二、分光光度法基本原理简介,分光光度法（spectrophotometry）是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为紫外分光光度法、可见分光光度法及红外分光光度法。,特点：灵敏度较高，适用于微量组分 (110gL-1)的测定；误差较大，相对误差达到25%。,
2、电磁波谱： X射线 0.1100 nm远紫外光 10200 nm近紫外光 200400 nm可见光 400760 nm近红外光 7502500 nm中红外光 25005000 nm远红外光 500010000 nm微 波 0.1100 cm无线电波 11000 m,1、物质的颜色与吸收光的关系,日光：紫 蓝 青 绿 黄 橙 红,复合光：由各种单色光组成的光。如白光(太阳光) 单色光：只具有一种波长的光。 要求：=2nm。 互补色光：如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可以得到白光，这两种光就叫互补色光。 物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。如：CuSO4呈兰
3、色。 物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。,互补光,2、物质的吸收曲线,M + 热,M + 荧光或磷光,E = E2 - E1 = h 各能级是量子化 ；选择性吸收; 分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；,M + h M *,基态 激发态 E1 （E） E2,用不同波长的单色光照射，测定吸光度，如果以波长为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为吸收曲线（ A曲线）。,（1）不同物质吸收曲线的形状和吸收波长不同。,MnO4-,531,吸收曲线,（2）同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似。,吸收曲线是特征的，可以提供物质的结构信息，作为物质定
4、性分析的依据之一；吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,3、光的吸收定律朗伯-比耳定律,吸光度A ：物质对光的吸收程度。 定义： Alg（I0/It) A越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。,1760年朗伯(Lambert)阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：Ab,1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：Ac,二者的结合称为朗伯比耳定律， Abc,朗伯比耳定律数学表达式：,Alg（I0/It)= b c 式中：A，吸光度，无量刚； b，液层厚度(光程长度)，cm； c，溶液的浓度， mol L -1 ； 称为摩尔吸光系数，Lmol-cm-1
5、，仅与入射光波长、溶液的性质及温度有关，与浓度无关。上式表明：当一束单色光通过溶液时，其吸光度与溶液浓度和宽度的乘积成正比。,T、A、c间的关系： A lg（I0/It) = -lg T = b c,透光度(透光率)T ：透过光和入射光强度之比，即 T= It /I0 100% T越大，表示对光的吸收越小。,吸光度具有加和性： 在多组分体系中，吸光度具有加和性，即： A（总） A1 + A2 + An = 1b c+ 2b c+ nb c,其方法和步骤是： 1）配制一组浓度不同的标准溶液(c1 、 c2 )； 2）在一定波长下，分别测定其吸光度(A1、A2)。 3）以A为纵坐标，浓度c为横坐标
6、，绘制曲线，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线（A-c曲线）。 4）用完全相同的方法和步骤测定待测溶液的吸光度Ax，从标准曲线上找出对应的浓度cx值（ Ax cx ）。,4、定量测定方法标准曲线法,标准曲线,a、目视比色法用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方法称为目视比色法。 特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不高。 b、分光光度计,5、 紫外可见分光光度计,仪器基本组成,光源,单色器,样品室,检测器,显示器,a. 光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500 nm。
7、紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。,b.单色器,又称波长控制器，其作用是将光源发射的复合光分解成单色光，并可从中选出一任波长单色光的光学系统。包括狭缝、色散元件和准光装置。色散元件的作用是将复合光分解成单色光，有棱镜或光栅两种。,c. 样品室,样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。 吸收池主要有石英池和玻璃池两种。,e. 结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,d. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,1、显色反应 2、显色反应条件的选择 3、测量条件的选择,6、 显色与测
8、量条件的选择,1）、显色反应 显色反应使无色或浅色的待测组分转变为有色化合物的反应。 显色剂与待测组分反应形成有色化合物的试剂成为。Fe2+3RFe(3R)2+ （红橙色，max=510 nm）R为邻二氮菲,2） 显色反应条件的选择,a.显色剂用量选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）的显色剂用量。,b.反应体系的酸度 选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）所对应的pH范围。 c.显色时间与温度 d.溶剂 一般尽量采用水相测定。,3）测定条件的选择,a.选择适当的入射波长一般选max为入射光波长。如果 max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。,b.选择
9、合适的参比溶液,为什么需要使用参比溶液？ 使测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。 A=A1+A2+A(x)， A1+A2+ =0, A=A(x) 。参比溶液的选择一般遵循以下原则： 若仅待测组分与显色剂反应产物有吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液； 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液； 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液；,c.控制适宜的吸光度（读数范围）,用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T =1565%，相应地吸光度 A =0.800.20。 当溶液的吸光度或透光率不
10、在此范围时，可以通过改变溶液浓度及选择不同厚度的比色皿来控制。,分光光度法测定铁的含量,一、实验目的 1、了解分光光度法测铁的基本原理； 2、学习分光光度法中显色与测量条件的优化与选择； 3、学习标准曲线的绘制以及试样测定方法； 4、了解分光光度计的性能、结构及使用方法。,二、实验原理A=bc 在一定实验条件下，A=kc，Ax值cx值。 pH39，Fe2+与Phen反应： Fe2+3RFe(3R)2+ （红橙色，max=510 nm） （注： Fe3+3RFe(3R)3+ ，兰色，max=600 nm ）用盐酸羟胺还原，再显色反应，则可以测得溶液中总铁含量： 2Fe3+2NH2OHHCl=2F
11、e2+N2+2H2O+2Cl-,三、实验步骤,1、吸收曲线的制作,试剂溶液：不加铁标，其余同上配制。,以试剂溶液作参比，在440560nm间，每隔10 nm测一次吸光度，并且绘制A-曲线，选择最佳测定波长。 注：每改变一个波长，就需用参比溶液重新调节仪器。,3、稳定性实验,试样溶液同实验1。 以试剂溶液作参比，在508 nm处，测定不同显色时间下的吸光度，并且绘制A-t曲线，考察反应时间的影响以及有色溶液的稳定性。,2、显色剂浓度的影响,试样溶液中除了邻二氮菲的加入量不同外，其余配制方法同实验1。 以试剂溶液作参比，在508 nm处，测定不同显色浓度下的吸光度，并且绘制A-V曲线，考察显色剂浓
12、度的影响。,4、溶液pH的影响,以试剂溶液作参比，在508 nm处，测定不同pH下的吸光度，并且pH计测定相应溶液pH值，绘制A-pH曲线，考察pH的影响。,5、标准溶液曲线的制作 按照书中方法配制0#8#溶液，以0#为参比溶液，测定1#8#溶液的吸光度值，并且绘制Ac标准曲线。 6、未知样中总铁含量的测定 按照书中的方法配制9#溶液，测定其吸光度值，从标准曲线中查得相应铁总含量。 7、未知样中Fe2+含量的测定 按照书中的方法配制10#溶液（即不加盐酸羟胺），测定其吸光度值，从标准曲线中查得相应亚铁含量。,四、实验注意事项,1、移液管专用； 2、注意移液管的使用方法，要求每次从零刻度放至所需的体积； 3、注意溶液的填加顺序，不能随意颠倒，加入盐酸羟氨后反应5min，再加NaAc和邻二氮菲,
