生物工程技术金钱松.doc-道客多多

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1、生物工程技术在提高金钱松有效组分生产中关键技术研究项目概述本项目首次将生物工程的组织培养技术、多倍体诱导技术、转基因技术和细胞悬浮培养技术有机结合，在离体培养条件下，成功地诱导培育出金钱松有效组分含量高、生长速度快的悬浮培养体系并诱导出优良、安全性高的金钱松试管苗；进一步探明金钱松四倍体悬浮培养物、转基因培养物中有效成分的积累动态和时空分布规律及生物工程的微生物分离技术、微生物培养技术、微生物菌种选育技术、微生物发酵技术及微生物基因工程，筛选出生产目标产物的内生菌并进行发酵培养

2、，优化培养条件、发酵工艺，利用基因工程技术定向改变其生理过程，稳定、高效、安全的生产目标产物。最终实现工业化生产金钱松药用成分及抗生素的目的。并完成对培养物中各化学物质的提取、分离和纯化的工艺研究；最终实现大规模工业化生产金钱松土槿酸药物有效组分，极大地缓解金钱松药材市场的紧缺、种子丰产时间长对其大量繁殖的明显影响和更有效地保护金钱松野生植物资源。一、项目研究主要目标、主要内容、技术关键、技术路线和应用

3、方案。1、主要目标：采用组织培养、多倍体诱导、转基因及微生物发酵等多项生物工程技术，初步建立金钱松有效组分规模化快速繁殖细胞系和微生物发酵工程，为金钱松有效组分工业化快速生产及大量繁殖组培苗奠定基础。2、主要内容（ 1）诱导金钱松幼苗选用优良的金钱松种子在适宜的温度、水分、光照、促发剂等条件下，经过适当的预处理

4、，分别通过土壤培养、培养皿培养以及无菌体系培养诱导其萌发，并采用均匀法筛选出金钱松中年种子萌发的最佳条件，并诱导成植株。（ 2）建立金钱松无菌繁殖体系选出生长健壮的金钱松幼苗，通过探讨其消毒条件、抗生素试验、最佳诱导分化培养基，建立金钱松愈伤组织无菌培养体系。（ 3）建立金钱松快速繁殖体系筛选出有效组分含量高、适

5、宜进行细胞悬浮培养的金钱松外植体；采用单因素试验和正交试验筛选出最佳培养基配方及培养条件，建立金钱松细胞悬浮培养体系。（ 4）建立金钱松低温保存技术为了保存金钱松的优良品质以及珍惜物种资源，从材料选择、材料预处理、冰冻保护剂、冰冻方法等的影响因素的探讨，建立高效的金钱松种质超低温保存技术。（ 5）建立金钱松 60Co

6、-r 射线诱导技术采取 60Co-r 射线诱导技术诱导金钱松遗传基础的改变，通过改变酶活性等提高金钱松的有效成分含量及重新组合得到有利用价值的金钱松突变体，并对 60Co-r 射线不同的剂量和辐射时间长短来进行研究。（ 6）建立金钱松多倍体诱导技术体系为了明显提高药材中有效组分的含量和增加药材的产量，对金钱松不同外植体进行实体人

7、工诱导加倍法和离体培养加倍法的多倍体诱导以及对诱导后材料进行形态学鉴定和染色体核型鉴定试验。将培养的外植体和种子用不同浓度的秋水仙素在不同温度，光照等条件下处理不同时间并对所诱导的多倍体材料进行细胞染色体核型鉴定，筛选出诱导成功的金钱松多倍体组织和最佳诱导条件。（ 7）建立快速高产的金钱松多倍体悬浮培养体系

8、采用均匀法对金钱松多倍体愈伤组织的悬浮培养基本培养基 MS、B5、 SH、 White 等的筛选；培养基中激素配比、各种附加物、接种量、光照条件、碳源、氮源、 pH 值等因素对培养细胞的生长速度和有效组分含量的影响研究；对金钱松多倍体悬浮细胞进行细胞活力的测定，测定培养细胞的生长曲线。（ 8）建立金钱松转基因体系为了提高金钱松有效

9、成分含量、生产速度以及新的药用成分的发现，采用农杆菌介导植物建立金钱松转基因体系并对诱导条件进行优化；对诱导后的材料进行 PCR 扩增实验选出转基因成功的材料，再对转基因成功的材料进行不定芽、不定根的诱导生产出转基因植株。（ 9）建立金钱松发根生产体系为了更快、更高质量的生产药物有效成分，将转基因诱导成功的发状根进

10、行离体发酵培养，初步生产药物有效成分，优化生产条件，初步建立金钱松发根生产体系。（ 10）多倍体及转基因培养产物成份累积及时空分布规律研究采用动态采样检测的方法，应用 HPLC 等检测技术对金钱松四倍体悬浮培养物和离体培养的发根系中有效组分的动态积累及时空分布规律进行研究。（ 11）建立金钱松内生菌培养体系筛选优良金钱松

11、外植体，培养、分离内生菌，通过不同氮源、碳源、诱导因子、温度、 PH 等因素的实验，确定最佳培养基和培养条件，建立金钱松内生菌培养体系。（ 12）筛选、分离、鉴别金钱松内生菌通过对金钱松内生菌的各种生物活性特性实验，筛选出能产生药物有效成分、抗生素类物质的目标菌种并运用微生物分离技术分离出目标菌种；运用微生物形态

12、学、细胞学、基因工程学等技术鉴别其所属。（ 13）建立产物特性菌种发酵培养体系将分离、鉴别后合成目标代谢产物的菌种进行发酵培养，通过对不同氮源、碳源、诱导因子、温度、 PH 等因素的实验，确定最佳发酵工艺，并绘制微生物生长曲线，确定其生长周期以及代谢产物动态积累曲线，建立金钱松特性内生菌发酵培养体系。（ 14）生产抗小

13、卷蛾金钱松植株将抗小卷鹅目的基因转入某菌种中，诱导生产抗小卷蛾 “工程菌 ”并采用微生物细胞学鉴定，筛选出转基因成功的内生菌将其导入诱导的无菌金钱松再生植株中，运用细胞学、生态学、基因工程学等手段鉴定转基因植株。生产抗小卷蛾金钱松植株。（ 15）初步建立基因代谢工程采用微生物酶和蛋白质工程的手段和方法研究目标菌种

14、的某些代谢控制酶和其底物的关系，初步探讨代谢途径，并将控制合成该酶的基因片段导入受体细胞中，影响其代谢途径，从而大幅度提高目的产物。（该研究初步）（ 16）金钱松培养产物和发酵产物分离纯化及药效毒理评价研究采用化学分离等技术对培养产物有效组分进行提取、分离和纯化工艺研究；采用比较药理学和毒理学方法对金钱松多倍

15、体悬浮培养产物、转基因诱导产物进行全面系统的药效学和安全性评价研究。（ 17）规模化快速繁育技术体系优化初步建立根据上述研究结果，优化培养条件，完善基于生物工程技术的金钱松有效组分的快速繁育，和微生物发酵关键技术，初步建立大规模工业化生产金钱松药材药用成分、抗生素和转基因植株的技术体系。3、拟采用的技术路线优良金钱

16、松种质外植体筛选无菌体系建立最佳培养条件的建立建立农杆菌诱导金钱松转基因培养物成分的测定与含量分析培养产物的药理学及安全性评价建立金钱松多倍体悬浮体系多倍体鉴定建立秋水仙碱诱导金钱松多倍体体系建立金钱松发根生产体系及转基因植物的诱导PCR 扩增鉴定初步建立金钱松四倍体悬浮培养和发状根发酵工业化生产关键技术金钱松 Co60诱导金钱松种质超低温保存外植体的选择金钱松无菌体系的建立筛选出金钱松愈伤组织诱导、增殖的最佳培养基和培养条件金钱松 Co60 诱导金钱松种质低温保存秋水仙素处

17、理不同浓度、时间以及处理方式的确定秋水仙素诱导离体培养体系的建立金钱松四倍体的形态学、细胞学的鉴定金钱松四倍体细胞的筛选金钱松四倍体细胞悬浮体系的建立农杆菌处理不同浓度、时间、温度等条件的确立农杆菌诱导金钱松体系的建立金钱松转基因产物的细胞学鉴定金钱松转基因产物的筛选金钱松发根体系的建立金钱松转基因植株

18、的诱导金钱松培养物成分的提取、纯化、结构分析和含量测定对金钱松培养产物进行全面系统的药理学和毒理学和安全性科学评价建立在离体培养条件下，大规模工业化生产金钱松有效组分和转基因植株的关键技术。优良金钱松外植体内生菌分离建立内生菌培养体系确定最佳培养配方和培养条件分离、筛选目标内生菌生理生化实验建立目标菌种发酵培养体系确定最佳发酵工艺构造抗小卷蛾的“工程菌”分离纯化代谢产物并分析、含量测定建立基因代谢工程酶合成代谢

19、研究生产抗小卷蛾金钱松植株初步建立目标微生物发酵产生药物有效成分和抗生素培养产物的药理学及安全性评价优良金钱松种子定殖实验外植体的选择金钱松无菌外植体的处理金钱松外植体的预培养金钱松内生菌的培养扩大培养、确定最佳培养配方和培养条件内生菌生物学特性实验筛选，形态学、细胞学的鉴定确定目标菌种抗小卷蛾基因的确定将小卷蛾基因转入某菌种获得工程菌细胞学鉴定工程菌将工程菌

20、转入金钱松再生植株抗小卷蛾金钱松植株的筛选建立目标内生菌培养体系优化培养条分离纯化代谢产物并分析、含量测定对代谢产物进行全面系统的药理学和毒理学和安全性科学评价研究代谢酶和底物的关系确定控制酶基因将控制酶基因转入目标菌种建立基因代谢工程初步建立目标微生物发酵产生药物有效成分和抗生素4、研究方案本课题的研究方

21、法是以生物工程的组织培养技术、多倍体诱导技术、细胞悬浮培养技术、转基因技术为支撑点，筛选出金钱松愈伤组织分化增殖的最佳培养基配方和培养条件，采用秋水仙素实体人工诱导加倍法和离体培养加倍法两种方式对金钱松不同外植体和种子进行多倍体诱导，诱导出金钱松同源四倍体，并运用细胞悬浮培养的技术建立高产、稳定的金钱松

22、四倍体细胞悬浮体系；采用农杆菌诱导金钱松转基因产物，并运用离体培养技术建立高效、高产、稳定、安全的金钱松发根培养体系和诱导转基因植株。同时以生物工程的微生物分离技术、微生物培养技术、微生物菌种选育技术、微生物发酵技术及微生物基因工程为支撑点，筛选出生产目标产物的内生菌并进行发酵培养，运用正交设计手段优化培

23、养基配方和培养条件，稳定高效的生产目标产物。采用化学分离等技术对培养产物有效组分进行提取、分离和纯化工艺研究；采用比较药理学和毒理学方法对金钱松多倍体悬浮培养产物、转基因诱导产物进行全面系统的药效学和安全性评价研究。最终实现工业化生产金钱松药用成分及抗生素的目的。（ 1）诱导金钱松幼苗选用优良的金钱松种子在

24、适宜的温度、水分、光照、促发剂等条件下，经过适当的预处理，分别通过土壤培养、培养皿培养以及无菌体系培养诱导其萌发，并采用均匀法筛选出金钱松中年种子萌发的最佳条件，并诱导成植株。（ 2）建立金钱松无菌繁殖体系选出生长健壮的金钱松幼苗，通过探讨其消毒条件、抗生素试验、最佳诱导分化培养基，建立金钱松愈伤组织无菌培养

25、体系。（ 3）建立金钱松快速繁殖体系筛选出有效组分含量高、适宜进行细胞悬浮培养的金钱松外植体；采用单因素试验和正交试验筛选出最佳培养基配方及培养条件，建立金钱松细胞悬浮培养体系。（ 4）建立金钱松低温保存技术为了保存金钱松的优良品质以及珍惜物种资源，通过单因素试验饿正交试验，从金钱松种质的类别、年龄、生理状态以

26、及冰冻保护剂、预处理方法、冰冻方法、解冻方法等的影响因素的探讨，建立高效的金钱松种质超低温保存技术。（ 5）建立金钱松 60Co-r 射线诱导技术采取 60Co-r射线诱导技术诱导金钱松遗传基础的改变，通过改变酶活性等提高金钱松的有效成分含量及重新组合得到有利用价值的金钱松突变体，并对 60Co-r射线不同的剂量和辐射时间长短以及外

27、植体种类、生理状况等来进行研究。并且为了观察射线对金钱松种子萌发的影响和希望提高金钱松种子萌发率，我们通过用 60Co-r射线对金钱松种子进行诱导处理。分别从种子的浸泡时间、浸泡温度、剥皮与否、辐射剂量、辐射时间等因素来研究金钱松种子的萌发率。以找出能诱导出有利材料的最适条件。（ 6）建立金钱松多倍体诱导技术体系为了

28、提高药材中有效组分的含量和增加药材的产量，选择生长状况良好的金钱松愈伤组织团块，以及已采用 KNO3 稀溶液处理低温保存的种子，使用将秋水仙素药剂用实体人工诱导加倍法和离体培养加倍法诱导金钱松多倍体；并依据不同的诱导材料，确立出使用秋水仙素溶液的最佳浓度、处理时间及处理条件，建立高效金钱松多倍体技术体系并对诱导

29、后的材料的形态学和显微结构进行鉴定。（ 7）建立金钱松转基因技术体系为了提高金钱松有效成分含量、生产速度以及新的药用成分的发现，采用农杆菌介导植物的方法，从基本培养基的种类、激素配比、光照条件、农杆菌浓度、农杆菌种类、预处理时间、共培养时间、抗生素浓度、培养温度、 pH 值等多方面进行深入研究，确立金钱松不同外

30、植体诱导发根的最佳条件，建立金钱松转基因体系；并对诱导后的材料进行 PCR扩增实验测定转基因外植体中的 rolB、 rolC 基因的整合，选出转基因成功的材料，再对转基因成功的材料进行不定芽、不定根的诱导生产出转基因植株。（ 8）建立快速高产的金钱松多倍体悬浮培养体系和多倍体培养产物成份累积及时空分布规律研究采用植物形态学、组

31、织学和细胞遗传学等技术对诱导后的材料进行多倍体鉴定，选择多倍体诱导率高、生长状况好和有效组分含量高的材料进金钱松行悬浮培养。为了进一步提高金钱松有效成分的生产效率以及为工业化生产打下基础，依据使用金钱松多倍体的材料，从基本培养基的种类、激素配比、接种量、光照条件、碳源、 pH 值等多方面进行深入研究，确立影响

32、金钱松多倍体细胞悬浮培养生长的最佳因素。测定培养细胞的活力，绘制出悬浮培养细胞的生长曲线，科学的确立多倍体悬浮培养的继代时间和生产周期。定时取样检测悬浮培养细胞中土槿酸化学物质的变化，弄清金钱松有效组分的积累动态和时空分布规律。开展生物转化研究，将悬浮培养基中的蔗糖浓度提高、改变培养基中无机盐含量、加入某

33、种微量元素和适当添加外源前体，进一步提高各金钱松有效组分的含量。（ 9）建立快速高产的金钱松发根液体培养体系和培养产物成份累积及时空分布规律研究采用形态学、 PCR 扩增等技术对诱导后的材料进行转基因鉴定，选择转基因成功、生长状况好和有效组分含量高的材料进金钱松发根液体培养体系培养。从基本培养基的种类、激素配比、光

34、照条件、温度、 pH 值等多方面进行深入研究，确立金钱松不同外植体诱导发根的最佳条件。测定培养细胞的活力，绘制出毛状根的生长曲线，科学的确立毛状根培养周期。定时取样检测培养物中土槿酸化学物质的变化，弄清金钱松发状根有效组分的积累动态和时空分布规律。开展生物转化研究，在培养液中适当添加营养元素、外源前体，进一步提

35、高各金钱松发状根继代速度和有效组分的含量。（ 10）建立金钱松内生菌培养体系筛选优良金钱松外植体，培养、分离内生菌，通过不同氮源、碳源、诱导因子、温度、 PH 等因素的实验，确定最佳培养基、培养条件以及最佳分离培养基及条件，建立金钱松内生菌培养体系。（ 11）筛选、分离、鉴别金钱松内生菌通过对金钱松内生菌进行各种生物活

36、性特性及生理生化实验，筛选出能产生药物有效成分、抗生素类物质、多糖类物质等其他有用成分的目标菌种，并运用微生物分离技术分离出目标菌种；运用微生物形态学、细胞学等技术鉴别其所属。（ 12）建立目标菌种发酵培养体系将分离、鉴别后合成目标代谢产物的菌种进行发酵培养，通过对不同氮源、碳源、诱导因子、温度、 PH 等因素的

37、实验，确定最佳发酵工艺，并绘制微生物生长曲线，确定其发酵周期以及绘制代谢产物动态积累曲线，建立金钱松目标内生菌发酵培养体系。（ 13）构造抗小卷蛾的 “工程菌 ”采用分子生物学和细胞遗传学方法，确定抗金钱松小卷蛾基因，并进行复制、剪切，将其导入某种菌株，构造抗金钱松小卷蛾 “工程菌 ”，采用分子生物学手段进行鉴定。（ 14）

38、生产抗小卷蛾金钱松植株筛选出构造成功的 “工程菌 ”将其导入诱导的无菌金钱松再生植株中，运用细胞学、生态学等手段鉴定转基因植株。生产抗小卷蛾金钱松植株。（ 15）分离纯化代谢产物并分析、进行含量测定采用动态采样、检测、分离的方法，应用 HPLC 等检测技术对发酵产物有效组分的动态积累及时空分布规律进行研究。（ 16）初步建立

39、基因代谢工程采用微生物酶和蛋白质工程的手段和方法研究目标菌种的某些代谢控制酶和其底物的关系，初步探讨代谢途径，并将控制合成该酶的基因片段导入受体细胞中，影响其代谢途径，从而大幅度提高目的产物。（该研究初步）（ 17）初步建立目标微生物发酵产生药物有效成分和抗生素根据上述研究结果，优化培养条件，完善基于生物工程

40、技术的金钱松内生菌发酵生产药物有效组分和抗生素的关键技术，初步建立大规模工业化发酵生产药用成分和抗小卷鹅转基因植株的技术体系。二、立项的必要性及国内外研究现状、发展趋势1、立项的必要性及国内外研究现状、发展趋势（ 1）金钱松资源状况分析金钱松 ( Pseudolarix kam eferi Gord. )是我国特有的著名古老孑遗松科 ( Pinaceae

41、)树种。据化石资料推断，金钱松大约起源于白垩纪中晚期 ,曾广泛分布于北纬 33 52地区，世大冰期后 ,各地金钱松相继灭绝 ,只有在长江中下游地区幸存下来。加上金钱松结子有大小年之分，一般 3 5年丰产一次，由此对其大量繁殖有明显地影响，同时残存个体稀少，分布零星，人为的破坏，使其生存环境受到严重威胁，现在正处于濒危状态 ,已被

42、列为国家二级保护植物。金钱松材性优良 ,耐水湿 ,树形优美 ,是优良的建筑、家具等用材树种；树干端直挺拔，树冠呈尖塔形，叶线形，长 3 7 cm，簇生于短枝端，形似古钱，叶初展色翠绿，入秋时转为金黄色，为世界闻名的五大观赏树种之一。据本草纲目抬遗第六卷木部记载： “汪连任采药书，罗汉松一名金钱樵，又名仓松，其皮治一切血，杀虫

43、痒癣，台芦荟香油调擦，按其主治应为金钱松。金钱松树皮和根皮 (中药名为土槿皮或土荆皮 ) 因为性辛 ,温 ,有毒 ,具有止痒杀虫的功能，外用于治手脚癣、神经性皮炎、湿疹。自 20世纪 80年代以来 ,金钱松的化学成分及其药理作用再次受到关注 . 研究发现 :金钱松的化学成分主要有二萜类化合物、三萜类化合物、木脂素类化合物、倍半萜类化合物

44、以及其他类型化合物，其中最主要的有效成分是属二萜类化合物的土槿酸。现代药理实验表明 :这类化合物还具有抗真菌、抗肿瘤、抗早孕、使胆囊自截等功效。这些研究结果预示着随着对金钱松活性成分的不断深入研究，其用途还将进一步增多。植物内生菌是指那些寄生在植物体中，度过全部或部分生活史而对植物组织没有引起明显病害症状的

45、真菌，由于内生菌长期生活在植物体微环境中，与之协同进化，在演化过程中二者形成了互惠关系。内生菌不仅能参与植物次生代谢成分的合成，或对植物次生代谢产物进行转化，而且还能够有效的抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性和独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物新的重要来源。最新研究表明某些植物内生真菌能产生与宿主

46、植物相同或相近的代谢产物和其它新的天然产物近来发现的天然产物 11% 来自植物和动物 3 8 % 来自土壤微生物而来自植物内生真菌的则占 51% 之多。内生菌存在于所有植物体中，但金钱松含有丰富的内生菌，何佳等人在快速筛选金钱松内生真菌抗真菌活性的研究中根据菌落培养特征，先后四次共从金钱松茎和叶中分离出内生真菌 105株。随着医

47、药卫生事业的发展，人们对金钱松的需求量还将进一步增加，最终导致其价格不断攀升，药材市场的缺口越来越大。（ 2）金钱松人工栽种现状分析大量开展人工栽种金钱松药材是解决其供不应求的重要途径。金钱松人工种植方式主要为有性繁殖和营养繁殖 2种情况。有性繁殖即种子繁殖，金钱松对环境适应力不强、结实率低、结实间隔期较长 (一

48、般 3 5 a结实 1次 )、采种条件苛刻（采种母树年龄以 100年左右为最好），尽管金钱松种子不存在形态后熟和生理后熟的特性但种子成活率低（成活率 60%-70%）、种子保存条件要求高（室内常温条件对保持金钱松种子的生命力极为不利，贮藏金钱松种子需过低的温度，尽管如此种子的发芽能力也只能保持两年且发芽能力仅相当于贮藏前发芽能力的

49、 50 以下）等特点也对金钱松大量繁殖有明显限制。无性繁殖即扦插繁殖，为 10年以下植株的枝条扦插，金钱松为菌根性树种，宜在海拔 500m 左右的山地建立永久性育苗基地，或在土内有菌的林间育苗，喜光爱肥，适宜酸性土壤，生长受气候因素影响明显加之整齐度不理想，生长周期长，易受金钱松小卷蛾 (Celpha pseudolaxicola Liu)的严重危害，轻则使金钱松叶枯，长势弱，重则使金钱松枯死，如湖南安化县芙蓉山林场的金钱松林因该虫的危害而枯死，以致砍伐殆尽这给金钱松药材野生抚育的人工栽培和生产管理带来了许多困难，同时也在很大程度上限制了金钱松药材的大规模生产。

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