1、酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理 方法类型及反应原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理 、 、试剂制备 试剂制备试剂制备试剂制备 和和和 和 临床意义临床意义临床意义临床意义 酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一 ，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术 。随着相关新技术的不断问世 ，如杂交瘤单克隆抗体技术 （使各种对抗原决定簇高度特异的单克隆抗体可以在体外批量生产 ）、 生物素 亲和素放大系统的应用以及与
2、化学发光和电化学发光技术的偶联等 ，明显地提高民分析和测定方法的特异性 、灵敏度及其自动化程度 ，使酶免疫技术不断更新 ，应用范围不断 拓宽 。当前 ，酶免疫技术已与形式各异 、各具特点和用途的定位、定量和超微量测定的标记免疫分析技术融合发展 ，在医学和生物学中的应用日益广泛 ，是取代放射免疫技术的主要方法之一 。 酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点 酶免疫技术是以酶标记抗原或酶标记抗体为主要试剂 ，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被测物进行定性或定量的标记免疫技术 。 基本原理基本原理基本原理基本原理 是：将酶与试剂抗原或抗体用交联剂结合起来 ，此种酶标记抗原或
3、抗体与标本中相应抗体或抗原发生特异反应 ，并牢固结合 ，在加入相应的酶的底物时 ，底物被酶催化生成呈色产物 ，在免疫组化染色时可指 示待测反应物的存在和定位 ，在酶免疫测定中 ，则可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察 。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上 ，故而该技术具有检测灵敏度高 、特异性强 、准确性好等特点 ，而且 ，可与其他技术偶联而衍生出适用范围更广的新方法 。 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 ，并保持其免疫活性 。 使抗原或抗体与某重酶连接成酶标抗原或抗体 ，且既保留其免疫活性又保留酶的活性 。 标本中的抗原或抗体 、标记抗原或抗体能按一定的次序与
4、固相载体表面的抗体或抗原反应 ，并通过底物与酶 的反应来反映标本中的抗原或抗体的量 。 酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类 ： ： 一一一 一、 、 、按检测对象的不同一般分为两类 按检测对象的不同一般分为两类按检测对象的不同一般分为两类按检测对象的不同一般分为两类 ： ： 1.酶免疫组织化学技术 （ enzyme immunohisto chemistry,EIH） : 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体 。 2.酶免疫测定技术 (enzyme immunoassay,EIA): 用于检测体液样本中可溶性抗原或抗体 。 二二二 二、 、 、根据抗原抗体反应
5、后是否需要分离结合的和游离的酶标记物 根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物 ， ，可分为 可分为可分为可分为 ： ： 1. 均相法 （ homogenous）： 不需要分离结合和游离的酶标记物 ，直接进行测定 。 2. 异相法 (heterogenous)：需要分离结合和游离的酶标记物后才能进行测定 。 酶免疫组化 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 液相酶免疫测定 必备试剂必备试剂必备试剂必备试剂 ： ： 固相抗原或抗体 -免疫吸附剂 酶
6、标记的抗原或抗体 -酶结合物 酶反应的底物 -底物 酶联试剂 阳性对照 酶标记物 显色液 A 终止液 反应板 显色液 B 浓缩洗涤液 加样枪与吸头 阴性对照 双抗体夹心法 ，属于非竞争结合测定 。它是检测抗原最常用的 ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原 ，而不能用于小分子半抗原的检测 。 工作原理工作原理工作原理工作原理 是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合 ，形成 固相抗体固相抗体固相抗体固相抗体 -抗原抗原抗原抗原 -酶标抗体免疫复合物酶标抗体免疫复合物酶标抗体免疫复合物酶标抗体免疫复合物 。由于反应系统中固相抗体
7、和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的 ,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比 (在方法可检测范围内 )。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量 (OD 值 )，即可确定待测抗原含量。 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于 双位点夹心法双位点夹心法双位点夹心法双位点夹心法 。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法 。 【 操作步骤 】 双抗原夹心法 ，属于非竞争结合测定 。它是检测抗体的 ELISA。 工作原理工作原理工作原理工作原理 是：利用连接于固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中
8、被检测抗体分子上两个抗原结合位点结合 ，形成固相抗原 -抗体 -酶标抗原免疫复合物 。由于反应系统中固相抗原和酶标抗原的量相对于待测抗体是过量的 ,因此复合物的形成量与待测抗体的含量成正比 (在方法可检测范围内 )。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量 (OD 值 )，即可确定待测抗体含量 。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合 ，则是双抗原夹心法。 双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法 - 操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤 ： ： 将特异性抗原包被固相载体 。孵育一定时间 ，使形成固相抗原 ，洗涤除去未结合的抗原和杂质 。 加待检标本 ，孵
9、育 ，使标本中的抗体与固相载体上的抗原充分反应 ，形成固相抗原抗体复合物 。洗涤除去其他未结合物质 。 加酶标抗原 ，孵育 ，使形成固相抗原 -待测抗体 -酶标抗原夹心复合物 。洗涤除去未结合酶标抗原 。 加底物显色 。固相上的酶催化底物产生有色产物 ,通过比色 ,测标本中抗体的量 。 间接法间接法间接法间接法 此法是测定抗体最常用的方法 ,属非竞争结合试验 。 基本原理基本原理基本原理基本原理 是将抗原连接到固相载体上 ，样品中待测抗体与之结合成固相抗原 -受检抗体复合物 ，再用酶标二抗 (针对受检抗体的抗体 ，如羊抗人 IgG 抗体 )与固相免疫复合物中的抗体结合 ，形成固相抗原固相抗原固
10、相抗原固相抗原 -受检抗体受检抗体受检抗体受检抗体 -酶标二抗复合物酶标二抗复合物酶标二抗复合物酶标二抗复合物 ，测定加底物后的显色程度 ，确定待测抗体含量 。 【 操作步骤 】 竞争法 ELISA 可用于抗原和半抗原的定量测定 ，也可对抗体进行检测 。 方法和特点方法和特点方法和特点方法和特点 : 酶标记抗原 （抗体 ）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原 ）结合的能力 反应体系中 ，固相抗体 （抗原 ）和酶标抗原 （抗体 ）是固定限量 ，且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原 （抗体 ）的分子量和 免疫反应后 ，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原 （抗体 ）的
11、量 （酶活性 ）与样品或标准品中非标记抗原 （抗体 ）的浓度成反比 【 【 操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤 】 】 捕获法捕获法捕获法捕获法 捕获法 （亦称反向间接法 ） ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分 （如 IgM）的测定 。以目前最常用的 IgM 测定为例 ，因血清中针对 某种抗原的特异性 IgM 和 IgG 同时存在 ，则后者可干扰 IgM 的测定 。 工作原理工作原理工作原理工作原理 ：先将针对 IgM 的第二抗体 （如羊抗人 IgM 链抗体 ）连接于固相载体 ，用以结合 （ “捕获 ”）样品中所有 IgM（特异或非特异 ）， 洗涤出去 IgG 等无关物质 ，然后加入特异
12、抗原与待检IgM 结合 ；再加入抗原特异的酶标抗体 ，最后形成 固相二抗固相二抗固相二抗固相二抗 - IgM-抗原抗原抗原抗原 -酶标抗体复合物酶标抗体复合物酶标抗体复合物酶标抗体复合物 ，加酶底物作用显色后 ，即可对样品中待检 IgM 是否存在及其含量进行测定 。 全自动设备全自动设备全自动设备全自动设备 ：酶和底物 ：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶 ，还有 -半乳糖苷酶 、尿酶等 。 1. 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase,HRP) 应用最广泛 。是从辣根菜中提取的酶类 ，由糖蛋白和辅基 （含铁血红素 ）构成 ，辅基为酶活性中心所在 ，在 403nm 波长处
13、有最大吸收峰 ，糖蛋白在 275nm 波长有最大吸收峰 ，故用 A403nm 与 A275nm 比值代表纯度 （ reinheir zahl,RZ）。用于酶 免疫技术的 HRP，其 RZ 值应大于 3.0。但注意酶纯度不代表酶活力 ，酶变性后 ， RZ 不变但活力下降 。 HRP 的底物有可溶性和不溶性两种的底物有可溶性和不溶性两种的底物有可溶性和不溶性两种的底物有可溶性和不溶性两种 。 不溶性底物不溶性底物不溶性底物不溶性底物 用于酶免疫组化技术 ： 3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐 （DAB）， 显色时呈棕黄色 ； 3-氧基 -9-乙基卡唑 ，呈红色 ； -萘酚 ； 4-氯-1-萘酚 ，呈灰蓝
14、色 ； 可溶性底物可溶性底物可溶性底物可溶性底物 用于酶免疫测定技术 ： 邻苯二胺 （OPD）， 呈橙红色 ，测定波长为 492nm，敏感性高 ，颜色稳定可维持数小时 ，对光 敏感 ； 四甲基联苯胺 （TMB）， 呈黄色 ，测定波长为 450nm； 5-氨基水杨酸 （5-ASA）， 呈棕色 ，测定波长为 550nm； 2. 碱性磷酸酶 （ alkaline phospharase,AP） 可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取 ，敏感性高 ，空白值低 。 AP 不溶性底物不溶性底物不溶性底物不溶性底物 ： 硝基蓝四氮唑 （NBT）和 5-溴-4-氯-3-吲哚基 -磷酸 （BCIP）混合液 ，是 AP
15、最敏感的底物 ，呈紫色 ； 坚牢红和萘酚 ASMX 混合液 ，呈红色 AP 可溶性可溶性可溶性可溶性 底物一般采用 对硝基苯磷酸酯 （ P-nitrophenyl phosphate,P-NPP）， 产物呈黄色，测定波长为 405nm。 酶标记物的制备酶标记物的制备酶标记物的制备酶标记物的制备 酶标记物的制备 ：抗原由于化学结构的不同 ，可用不同的方法与酶结合 ，如为蛋白质 ，可参照抗体酶标记的方法 ，酶标记抗体的制备一般用戊二醛法和过碘酸盐法 。 1. 戊二醛法戊二醛法戊二醛法戊二醛法 ：戊二醛是一种双功能团的交联剂 ，分别与酶分子和免疫球蛋白分子上的氨基结合。戊二醛交联可用一步法 （如连接
16、 AP）， 也可用二步法 （如连接 HRP）。 一步法 ：将 2 5mg 纯抗体与 5mgAP 混合于 0.1mol/L pH 6.8 的磷酸盐缓冲液 1ml 中， 4下用同上缓冲液透析平衡 。磁力搅拌下加入 1%戊二醛 0.05ml，在室温下放置 2h，在 4下用0.05mol/L pH 8.0 Tris 缓冲液透析平衡 ，即可 。 二步法 ：第一步将过量的戊二醛与酶反应 ，使酶仅与戊二醛结合 ；第二步是除去多余的戊二醛分子 ，加入免疫球蛋白 ，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合 ，形成一分子酶和一分子免疫球蛋白结合物 。 2. 过碘酸盐法过碘酸盐法过碘酸盐法过碘酸盐
17、法 ： 取： HRP 5mg 溶于 0.2mol L pH 5.6 醋酸盐缓冲液 0.5ml 中，充分溶解后加入临用前配制的 0.1mol L NaIO4 0.25ml，混匀 ，于 4氧化 30min（勿超过 ）。 加入 2.5%乙二醇 0.5ml，室温下放置 30min 终止氧化 。 加入侍标记抗体 （ 球蛋白或 IgG）或抗原 5 10mg，用 1.0mol/L pH 9.5 CBS 调 pH 至 9.0，混匀 。 4过夜 ，使 HRP 与抗体或抗原结合 。 加 NaBH4 0.1ml（ 0.5mg）， 混匀 ， 4 2h，使形成的酶结合物稳定 。用 0.01mol L pH 7.4 PB
18、S 透析 ， 4过夜平衡 。 用戊二醛法和过碘酸盐法标记后 ，应将酶标记物纯化 ，常用的提纯方法为 50%饱和硫酸铵和Sephadex G200(或 G150)凝胶过滤 。 标记率测定 ：标记率以 A403nm A280nm 比值表示 ，是 HRP 的正铁血红素辅基特异吸光度(A403nm)与抗体球蛋白和酶蛋白中的色氨酸 、酪氨酸等的吸光度 (A280nm)之比 ，表示酶标抗体中 HRP 所占的比例 。标记率与 HRP IgG 摩尔比 （ E P）呈高度正相关 。标记率为 0.4 时， E P 之比约为 1。一般以标记率 0.3 0.6 为合格 。 固相载体固相载体固相载体固相载体 固相载体
19、：最常用聚苯乙烯 ，载体形状有小试管 、小珠和微量反应板 。良好的载体应该是吸附性能好 、不参与化学反应 、能使抗原或抗体保持免疫学活性 、空白值低且透明度高 。 1. 固相载体的选择固相载体的选择固相载体的选择固相载体的选择 ：用其他免疫学方法选出一个典型的阳性标本和典型的阴性标本 ，将他们进行一系列稀释后 ，在不同的固相载体上按预定的 ELISA 操作步骤进行测定 ，在哪一种载体上阴、阳结果差别最大 ，这种载体就是这一 ELISA 测定的最合适的固相载体 。 2. 固相载体的常规检查固相载体的常规检查固相载体的常规检查固相载体的常规检查 ：以一定浓度的人 IgG（一般为 10ug/L）包被
20、 ELISA 各孔后 ，每孔加入适当稀释的酶标抗人 IgG 抗体 ，按 ELISA 的操作步骤进行保温 、洗涤 、显色 、终止反应 ，测定每孔的吸光度 ，计算平均值和 CV%， CV%应小于 10%。 抗原和抗体抗原和抗体抗原和抗体抗原和抗体 抗原和抗体 ：要求抗原纯度高 ，抗体效价高 、亲和力强 。 免疫吸附剂的制备免疫吸附剂的制备免疫吸附剂的制备免疫吸附剂的制备 免疫吸附剂的制备免疫吸附剂的制备免疫吸附剂的制备免疫吸附剂的制备 （ （ 点击播放点击播放点击播放点击播放 ） ） 免疫吸附剂的制备 ：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂 ，将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，若以聚苯
21、乙烯为载体 ，包被方法是 ：将抗原或抗体溶于缓冲液 （最常用的为 pH9.6 的碳酸盐缓冲液 ）中， 加入 ELISA 板孔中在 4过夜后甩弃孔内液体 ，用洗涤液清洗即可 。如果包被液中蛋白浓度过低 ，固相载体表面不能被此蛋白完全覆盖 ，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白也会 部分地吸附于固相载体表面 ，最后产生非特异性显色而导致本底偏高 。在这种情况下，如在包被后再用 1% 5%牛血清白蛋白包被一次 ，可以消除这种干扰 。这一过程称为 封闭封闭封闭封闭(blocking)。 乙肝乙肝乙肝乙肝 “两对半两对半两对半两对半 ”检测结果临床意义检测结果临床意义检测结果临床意义检测结果临床意义 乙
22、肝 “两对半 ”检测结果临床意义 - - （ 1） HBsAg (2) 抗 -HBs (3)HBeAg (4) 抗 -HBe (5) 抗 -HBc 、 机体内无乙肝病毒存在 。 、 俗称 “大三阳 ”急慢性乙型肝炎 。提示 复制 。 、 急性 感染 。传染性弱 。 、 俗称 “小三阳 ”。病毒复制繁殖能力较低 ，传染性教小 。 、 既往感染 ，已有免疫力 。非典型恢复期 ，急性 感染 。 、 既往感染过 。急性 感染恢复期 。少数标本仍有传染性 。 、 被动 、主动免疫后 。 感染后已康复 。 、 既往感染过 。急性 感染窗口期 。 、 急性 感染康复 。既往感染过 。 、 急性 感染早期 。慢性 HBsAg 携带者 。传染性弱 。 、 早期 感染或慢性携带者 ，传染性强 。 、 急性 感染 ，趋向恢复 。慢性携带者 。 、 亚临床型 感染早期 。不同亚型 二次感染 。 、 同 。 、 亚临床型或非典型性感染 。 、 同 。 、 亚临床型或非典型性感染早期 。 、 非典型型急性感染 。提示非甲非乙型肝炎 。 、 非典型性急性感染 。 、 急性 感染中期 。 、 感染后已恢复 。 、 非典型性或亚临床型 感染 。 、 同 。 、 急慢性 感染趋向恢复 。 以上仅供临床参考 ，诊断病情需结合其他化验 、检查及病人具体病情 。 酶免疫标记图库酶免疫标记图库酶免疫标记图库酶免疫标记图库
