1、3D 多细胞肿瘤球的培养原创 2017-04-20 医生科研助手 3D 多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。与传统的 2D 贴壁细胞培养模型相比，3D 多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。因此，3D 多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。虽然 3D 多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与 2D 贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的 3D 多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和
2、表征手段。本文利用 Liquid Overlay 的制备方法，以乳腺癌细胞 MDA-MB-231 和 MCF-7 为模型制备 3D 多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行详细表征。1实验前准备工作1.提前 24 h 取 12 mL DMEM 和 RPMI 1640 完全培养基（含 10%FBS，下同）于 50 mL 离心管内，置于 4冰箱中预冷；2. 将分装好的 Matrigel 基质胶提前 24 h 从-20放入 4，使其融化成液体状态；3. 将无菌的 1 mL 移液器枪头放入无菌 50 mL 离心管内，置-20冰箱预冷。2琼脂糖包被 96 孔板1. 准确量取
3、6 mL RPMI 1640 培养基（或 DMEM 培养基）于 2 个 10 mL 的注射玻璃瓶内，加入 90 mg 琼脂糖，盖塞后放入 80的水浴锅内加热溶解 30 min；2. 加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115灭菌 30 min；3. 灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔 60 L 的量加入 96 孔板内。注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至 96 孔板中。此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和 100 L 的移液器枪头。4. 加入完成后
4、，96 孔板要保持水平约 30 min 使孔内的琼脂糖凝固。3配置含 Matrigel 基质胶细胞悬液1. 取对数生长期的 MDA-MB-231 细胞（或 MCF-7 细胞），胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用 RPMI 1640 完全培养基（或 DMEM 完全培养基）将细胞悬液浓度调整至 2.0105 cells/mL，备用。2. 将盛满碎冰的烧杯喷完酒精后放入超净台内，将 RPMI 1640 完全培养基以及解冻的 Matrigel 基质胶从冰箱内取出置于冰上。注意：由于 Matrigel 基质胶在室温下溶液凝固，因此在操作过程中一定要保持低温。3. 将预冷的移液器枪头取出放置于超净台内。根据计
5、算量（2.5%，v/v）用移液器将 300 L Matrigel 基质胶加入到 12 mL RPMI 1640 完全培养基内，迅速混匀。注意：由于 Matrigel 基质胶在室温下溶液凝固，因此使用的移液器枪头也需要预冷。4. 加入步骤 1 中的细胞悬液（约 600 L），使细胞浓度为 10000 cells/mL，迅速混匀，备用；4将细胞悬液铺入琼脂糖包被的 96 孔板1. 将上述步骤 4 中配置好的含有 Matrigel 基质胶的细胞悬液放入加样槽内，用多通道移液器吸取 200 L 加入到包被琼脂糖的 96 孔板内。2. 采用低温离心机进行离心，离心条件为 4，1000g，10 min。注
6、意：离心 96 孔板时为保持无菌，将 96 孔板的周围用封口膜封住。3.离心完成后，取出 96 孔板，摘下封口膜，喷洒酒精后放入培养箱内培养。整个培养流程如图 1 所示。4. 在培养的第 3、5 和 7 天，更换孔内的 100 L 培养基并采用倒置显微镜观察肿瘤球的形态。5.若要采用 3D 多细胞肿瘤球进行药物试验，在培养 7 天后，用移液器取出孔内的 100 L 培养基，加入 100 L 给药溶液，然后置于培养箱内培养并定期采用倒置显微镜观察肿瘤球的生长状况（图 2）。53D 多细胞肿瘤球的表征1. 倒置显微镜观察 3D 多细胞肿瘤球形态：直接将 96 孔板置于倒置显微镜下观察即可。2. 激光共聚焦显微镜观察：用移液器小心取出孔内的肿瘤球，用 PBS 清洗 3 遍后，采用 4%多聚甲醛固定，并用 Hoechst 33258 对细胞核进行染色，PBS 清洗3 遍后在激光共聚焦显微镜下观察（图 3）。3.环境扫描电镜观察：用移液器小心取出孔内的肿瘤球，用 PBS 清洗 3 遍后，固定干燥后进行环境扫描电镜观察（图 4）。图 4
