1、透明质酸的稳定性考察郭凤仙 郭学平 李国民透明质酸（Hyaluronic Acid，简称 HA）是 1934 年 Mayer 发现并命名的。国内外对 HA 的性质、生物活性、生产工艺、临床应用等方面都进行了广泛深入的研究，目前主要应用于医药和化妆品方面。HA 是由糖苷键相连接的氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的双糖单位重复连接组成的直链聚合物，羧基上的负电荷和较长的可折叠分子链使得分子空间伸展特别大，因此 HA 溶液具有较高的黏度 1，分子量越大，黏度越高。HA 分子链降解后，主要表现为黏度下降。本实验通过改变 HA 存放时的温度、酸碱度和离子强度，定期测其运动黏度，对 HA 的稳定性进行了考察。1 材
2、料与方法1.1 仪器与试剂恒温水浴（0.1 C） ；平氏黏度计（毛细管内径为 1.0mm0.05mm） ；电热恒温培养箱；电热恒温干燥箱 ；pH 计。HA，山东福瑞达生物化工有限公司生产，批号 20000217 、20000219； 0.1mol/L NaOH、0.1mol/L HCl。1.2 方法1.2.1 HA 运动黏度的测定 2 精密称取按干品计算的 HA 粉末 0.1g 于 100ml 容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至刻度，在 25C 恒温水浴中，测定其在平氏黏度计中的流出时间（s ） ，与该黏度计的黏度计常数（mm 2/s2）相乘，即得 HA 的运动黏度，以 mm2/s 为单位。1.2.
3、2 温度对 HA 稳定性的影响1.2.2.1 温度对固体 HA 稳定性的影响 将 HA 配成 0.1%(g/ ml)的水溶液，测其运动黏度，作为初始黏度。分别称取 HA 固体粉末约 1g 于容量瓶中，置 4C、28 C、 40C、60C、80 C、100C下恒温保存。一定时间后分别取出，配成 0.1%的水溶液，测定运动黏度。1.2.2.2 温度对 HA 溶液稳定性的影响 将 HA 固体粉末用蒸馏水溶解，配成 0.1%的溶液，分装于容量瓶内，在上述温度下恒温保存，定时取样测定运动黏度，方法同上。1.2.3 酸碱度对 HA 溶液稳定性的影响取 HA 固体粉末 1.25g，用 0.9%的 NaCl
4、配成 0.25%HA 溶液 500ml,调 pH为 7，测其运动黏度,作为初始黏度。再将 HA 溶液分装于 5 个烧杯内，分别用移液管滴加 NaOH 或 HCl 试剂，使溶液 pH 值分别为 5、6、7、8、9。五个烧杯于 80C 下恒温保存 12h 后取出 ,分别调 pH 值为 7.0，补加 0.9%的 NaCl 或蒸馏水使 NaCl 浓度及 HA 浓度相同，测其运动黏度。1.2.4 离子强度对 HA 溶液运动黏度的影响取 1g HA 固体粉末配成 0.2%的溶液 500ml，再分别配制4、3、2、1、0.4、0.2mol/L 的 NaCl 溶液各 50 ml。量取 HA 溶液 50ml 6
5、 份分别加入上述 6 种盐溶液混匀。然后分别测其运动黏度（0.1%HA 水溶液运动黏度为空白黏度） 。2 结果2.1 温度对 HA 稳定性的影响结果见图 1、图 2 和图 3、图 4。010203040500 20 40 60保 存 时 间 （ 天 ）运动粘度(mm/s)42840600102030400 20 40 60保 存 时 间 (小 时 )运动粘度(mm/s)80100图 1 固体 HA 不同温度保存时运动黏度测定结果010203040500 10 20 30 40保 存 时 间 (天 )运动粘度(mm/s)42840600102030400 10 20 30 40 50 60保 存
6、 时 间 （ 小 时 ）运动粘度(mm/s)80100图 2 HA 溶液不同温度保存时运动黏度的测定结果010203040500 20 40 60 80保 存 温 度 （ ）运动粘度（mm /s)固 体液 体图 3 HA 放置 10 天时运动黏度与温度的关系0102030400 10 20 30 40 50 60保 存 时 间 （ 小 时 ）运动粘度（mm /s)80100图 4 固体 HA80C 和 100C 保存时运动黏度与时间的关系2.2 酸碱度对 HA 溶液稳定性的影响结果见图 5图 5 不同 pH 值对 HA 溶液运动黏度的影响2.3 离子强度对 HA 溶液运动黏度的影响结果见图 6
7、。036912151821240 1 2 3氯 化 钠 浓 度 （ mol/L)运动粘度（mm /s)图 6 不同离子强度对 HA 溶液运动黏度的影响3. 讨论图 1、图 2 和图 3、图 4 表明，温度对 HA 的稳定性影响很大，HA 的存放状态不同，稳定性不同。HA 的最佳保存方式为冷藏，溶液状态 HA 比固体状态0510152025300 2 4 6 8 10pH值运动粘度（mm /s)HA 稳定。这可能与溶液状态下 HA 与空气中的氧气接触比固体状态下少有关，因溶液状态下 HA 分子间的空气均被排出。固体 HA 40C 保存 10 天，其运动黏度下降 18.4%；而 HA 溶液 40C
8、 保存一个月运动黏度基本不变。 80C、100C放置 48h，两种状态 HA 运动黏度下降十分明显，这说明 HA 在温度较高时不稳定,但 HA 溶液在 80C 加热 4h 和 100C 加热 1h, 运动黏度稍有下降，说明 HA溶液可进行巴氏消毒。此结果对含 HA 的医药制剂和化妆品的生产中的灭菌问题，具有重要意义。生产过程中可单独对 HA 溶液进行巴氏消毒，也可与其他料液混合后或乳化时进行巴氏消毒。以往许多人有一种误解，认为 HA 溶液不能加热灭菌，否则会导致降解。图 5 表明，pH 值为 6、7、8 时运动黏度变化不大， pH 为 5 时运动黏度下降最为明显。pH 为 7 时运动黏度最大。
9、这说明 HA 在中性时稳定性最好，所以生产时要求 pH 值尽量维持在中性状态。pH 值分别为 5 和 6 的 HA 溶液在 80C 放置 12h 后重新测 pH，pH 值均有所升高，这可能是酸破坏 HA 结构所致，这一点在 HA 生产中也应注意。从图 6 可以看出，0.1%HA 溶液当 NaCl 浓度由 0 增加到 0.1mol/L 时，运动黏度从 23.5 降至 2.41，变化显著，当浓度再逐渐增加时，运动黏度基本不变，不再随离子强度的增加而降低。这提示我们在生产或使用 HA 时，其过程中如有盐生成或需加入盐时应充分考虑离子强度对 HA 运动黏度所产生的影响。实验中所选温度根据实验室现有条件
10、而定，实验时为尽量减少称量误差，需一次配好溶液，然后分装，在配制 HA 溶液时，需加入防腐剂甲醛，其浓度为0.1，否则溶液在整个实验过程中可能长菌，特别是溶剂为生理盐水时，溶解过程中，溶液如变混，即可能已有菌生成。考察酸碱度对 HA 的影响时，最后溶液离子浓度、pH 值、HA 浓度都调至相同，即各溶液在测定时条件一致，这是为了排除测定时这些因素对 HA 运动黏度所产生的其它影响。参考文献 1 王凤山，凌沛学，郭学平，等. 生化药物研究. 北京：人民卫生出版社，1997：266271 2 国 家 药 典 委 员 会 .中 华 人 民 共 和 国 药 典 ， 北 京 ： 化 学 工 业 出 版 社 ，2000： 4446（ 附 录 ）原文发表于：山东省药学会第五次生化药物学术研讨会论文集，济南，2001， 4852
