1、IgG 的分离与提纯：硫酸铵沉淀法点击次数： 201 发表于：2008-08-23 16:56 转载请注明来自丁香园 来源：丁香园以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。 球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的 75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化 IgG。纯化 IgG 小量几十 ml
2、的话，用 protein A 或 protein G 就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百 ml，可以使用 streamline protein A。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。实验室中常用硫酸铵沉淀后过 DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。下面以此方法为例介绍 IgG 的分离与提纯。一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵 800g850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以 28NH4OH 调 pH 至 7.0（不调 pH 值也可以）。注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须
3、除去重金属，可在溶液中通入 H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发 H2S 即可。3、0.01Mol/L pH7.4PB 液A 液： 0.10Mol/L NaH2PO4 液NaH2PO42H2O 15.60g加 H2O 至 1000.mlB 液： 0.10Mol/L Na2HPO4 液Na2HPO412H2O 35.80g加 H2O 至 1 000ml取 A 液 19ml，B 液 81ml 加水至 1000ml 即可。4、1%BaCl2 溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加 H2O 至 500.00ml溶化后过滤，然后再加 20%NaOH500.00ml，混合即可。6、0.50
4、Mol/L 的 HCl 液和 0.50 Mol/L 的 NaOH 液7、洗脱液0.03Mol/L 的 NaCl 液。8、透析袋（或玻璃纸）二、操作方法1、取 20ml 血清，加生理盐水 20ml，再逐滴加入（NH4） 2SO4 饱和溶液10ml，使成 20%（NH4） 2SO4 溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置 30min。2、3000r/min 离心 20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。3、在上清液中再加（ NH4） 2SO4 饱和溶液 30ml，使成 50%（NH4） 2SO4 溶液，充分混合，静置 30min。4、3000r/min 离心 20min，弃上清。5、于沉淀中加 20ml
5、 生理盐水，使之溶解，再加（NH4） 2SO4 饱和溶液 10ml，使成 33%（NH4） 2SO4 溶液，充分混合后，静置 30min。6、3000r/min 离心 20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤 5，23 次。7、用 10ml 生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。8、透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于 4透析 24h，中间换液数次。以 1%BaCl2 检查透析液中的 SO42-或以纳氏试剂检查 NH4 （取 34ml透析液，加试剂 12 滴，出现砖红色即认为有 NH4 存在），直至无 SO42-或NH4 出现为止。也可采用 SephadexG25 或电透析除盐。9、离心去沉
6、淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提 IgG （即 球蛋白，如以 36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin ，含 球蛋白）。10、过 DEAE纤维素层析柱。以 0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。也可采用 SephadexG150 或 G200 柱。11、蛋白质及其定量鉴定。12、IgG 的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。（1）区带电泳玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在 球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4） 2SO4 盐析样品进行电泳，以资比较。（2）琼脂双相双扩散鉴定预先准备
7、该 IgG 免疫异种动物所获的抗 IgG 血清。将 IgG 与抗 IgG 血清进行双相双扩散，如 IgG 提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。（3）免疫电泳鉴定孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗 IgG 血清，琼脂扩散 24h，观察结果。如果提取的 IgG 纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于 球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。（4）圆盘电泳鉴定用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的 IgG 则只有一条区带。13、IgG 的浓缩与保存（1）IgG 的浓缩（2）IgG 的保存一般浓缩至 1%以上的浓
8、度，再分装成小瓶冻干保存，或加 0.01硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。四、蛋白质的分离纯化从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。对于异类物质，提纯蛋白质和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶水解，有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等方法处理。小分子物质常在整个制备过程中通过多次液相与固相转化中被分离或最后用透析法除去。而对同类物质如酶与杂蛋白、RNA、D
9、NA 以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间产分离，情况则复杂得多。主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等。其中盐析法、等电点法及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多，有机溶剂抽提和沉淀用于核提纯较多，柱层析法、梯度离心法对蛋白质和核酸的提纯应用十分广泛。如前所述，蛋白质的分离纯化较难，而且其本身的性质又限制了某些方法的使用，因此要研究目的物的微细特征，巧妙的联用各种方法并进行严密的操作，同时有必要了解精制各过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白质可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加为尺度进行追踪。其他蛋白质可用电泳、超离心、层析、
10、扩散及溶解等测定纯度。如结晶核糖核酸酶经层析分为两个成分。可见对确定蛋白质结晶纯度尚无最终的尺度。根据经验即或纯净的标准品，有极微量的不纯物时，也会给实验带来较大的影响。不稳定的蛋白质，如分离SH-酶时使用试剂及缓冲液等，要确认不含重金属离子（特级试剂也需检定）。蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与低分子化合物不同，必须经过独特的繁琐操作。蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的各种性质的微小差别。诸如分子形状、分子量大小、电离性质、溶解度、生物功能专一性等。蛋白质提取液中，除包含所需要的蛋白质（或酶）外，还含有其它蛋白质、多糖、脂类、核酸及肽类等杂质。除去的方法有：1）核酸沉淀法该法可用核
11、酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。必要时也可用脱氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗匀浆中加入少量 DNase,于 4保温 3060min，可使 DNA 降解为足够小的碎片，以致不影响以后的纯化。2）醋酸铅沉淀法利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。因这些沉淀剂也常常使需要的酶（或蛋白质）缓缓变性而失去活性，所以用这类试剂时应迅速进行盐析，使样品与这类试剂脱离接触。3）调 pH 值或加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。利用蛋白质的热变性的温度系数差异，可在一定的 PH 下将蛋白提取液加热到一定的温度，使对热不稳定的杂蛋白性沉淀而除去。4）选择性变性法利用各种蛋白质稳定性的不同，可用选择性变
12、性法来除去杂蛋白。例如胰蛋白酶及细胞色素 C 等少数特别稳定的酶，甚至可用 2.5%三氯醋酸处理，此时其它杂蛋白均变性而沉淀，而胰蛋白酶和细胞色素 C 则仍留在溶液中。5）透析法小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离，或最后用透析法除去。 1、利用溶解度不同的纯化方法原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也最早。至今还广泛使用，一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用盐析法得到纯的蛋白质的例子。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加（盐溶，与离子强度 101 间成比例增加）。球蛋白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程
13、度下降并先后析出（盐析）（离子强度 I210）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。盐析时蛋白质的溶解度与溶液中离子强度的关系，可用下式表示：S1g-=-kslSo式中 S0 为蛋白质在纯水（离子强度 I=0）中的溶解度，S 为蛋白质在溶液的离子强度为 I 时的溶解度，KS 为盐析常数。离子强度可用
14、下式计算。： 1I=-miZi22式中 mi 为溶液中各种离子摩尔浓度，Zi 为各种离子的价数。 式中当温度一定时，S0 对于某一蛋白质在某溶液中的溶解度是一常数，故（1 ）式也改定为：lgS=-ksI式中 =lgS0，也为一常数， 值主要取决于蛋白质性质，其次与溶液的 PH 和温度有关。ks 值主要和盐的性质（包括盐离子价数和平均半径）有关，也与蛋白质结构有关。一般来说，蛋白质在某一盐液中 ks 愈大，盐析效果愈好。蛋白质是具有许多亲水基团的偶极离子，常需用要较高的 I 值才能从溶液中析出。根据（ 3）式分离纯化蛋白质，可在一定的 PH 和温度下改变盐的 I 值，称为“ks 分段盐析法”，提
15、纯前期常应用此法；也可在一定 I 值下改变 PH 及温度，称为“ 分段盐析法”，常用于提纯后期，特别是使某些蛋白质结晶析出时。盐的选择：如上所述，蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目，即取决于蛋白质的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白质的溶解度。控制方法最常用的是加入中性盐。主要有硫酸铵、硫酸镁 、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25时饱满和溶解度为 4.1mol,即 767g/l;0时饱满和溶解度为 3.9mol,即 676g/l）。在这一溶解度范围内，许多蛋白质均可盐析出来，且硫酸铵价廉易得，分段效果较其它
16、盐好，不易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时对蛋白氮的测定有干扰，另外缓冲能力较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是 30以下溶解度太低。其它的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。氯化钠的溶解度不如硫酸铵，但在不同温度下它的溶解度变化不大，这是方便之处。它也是便宜不易纯化的试剂。硫酸铵浓溶液的 PH 常在 4.55.5之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH 值往往降至4.5 以下,当用其他 PH 值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节 .硫酸铵饱和度计算及加入方式在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的
17、饱和度为 100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有 3 种。一种是当蛋白质溶液体积不大所需调整的浓度不高时，加入饱和硫酸铵溶液。配制法是加入过量的硫酸铵，热至 5060保温数分钟，趁热滤去沉淀，再生 0或 25下平衡 12 天，有固体析出时即达 100%饱和度。盐析所需饱和度可按下式计算：S2 - S1V=V0-1 - S2式中 V 及 V0 分别代表所需饱和硫酸铵溶液及原溶液体积，S2 和 S1 分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。严格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，但这由体积改变所造成的误差一般小于 2%，可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积
18、又不再过分增大时，可直接加固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：G（S2 - S1）X = -1-AS2式中 X 是将 1I 饱和度为 S1 的溶液提高到饱和度为 S2 时所需硫酸铵的重量（g），G 及 A 为常数，与温度有关。G 在 0 时为 707，20 时为 756，A 在 0时为 0.27，20时为 0.29。在室温及 0 时所需硫酸铵饱和度可查表。第 3 种调整饱和度的方法是将盐析的样品液装于透析袋内对饱和硫酸铵进行透析，此法浓度变化较连续，不会出现盐的局部过高现象，但盐析时测定盐的饱和度手续较繁，运用较少。确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法将少量样品冷却到 05 ，然后搅拌加入固体硫酸
19、铵粉末，见蛋白质产生沉淀时，离心除去沉淀，分析上清液确定所要蛋白质的浓度，如它仍在溶液中则弃去沉淀，再加更多的硫酸铵于上清液中，直到产生蛋白质沉淀时止。以所要提取的蛋白质在溶液中的浓度对硫酸铵浓度作图，得沉淀曲线，找出蛋白质开始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间可取得窄一些，使纯度高一些。盐析时注意的几个问题：盐的饱和度 不同蛋白质盐析时要求盐的饱和度不同。分离几个混合组成的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第 2 种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质饱和度达 20%时，纤维蛋白原首先析出；饱和增至2833%
20、 时，优球蛋白析出；饱和度再增至 3350%时，拟球蛋白析出；饱和度大于 50%以上时清蛋白析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，可从牛胰酸性提取液中分离得到 9 种以上蛋白质及酶。PH 值pH 值在等电点时蛋白质溶解度最小易沉淀析出。因此盐析时除个别特殊情况外，pH 值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。由于硫酸铵有弱酸性，它的饱和溶液的 pH 值低于 7，如所要蛋白质遇酸易变性则应在适当缓冲液中进行。蛋白质浓度 在相同盐析条件下蛋白质浓度愈高愈易沉淀。使用盐的饱和度的极限也愈低。如血清球蛋白的浓度从 0.5%增至 3.0%时, 需用中性盐的饱和度的最低极限从 29%递减至 24%.某一蛋白质欲
21、进行两次盐析时,第 1 次由于浓度较稀,盐析分段范围较宽,第 2 次则逐渐变窄.例如胆碱酯酶用硫酸铵盐析进时，第 1 次硫酸铵饱和度为 35%至 60%,第 2 次为 40%至 60%.蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过高也易引起杂蛋白的共沉作用 .因此,必须选择适当浓度尽可能避免共沉作用的干扰。温度由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行。至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。通常蛋白质盐析时对温度要求不太严格。但在中性盐中结晶纯化时，温度影响则比较明显。脱盐蛋白质用盐析法分离沉淀后，常需脱盐才能获得纯品。脱盐方法最常用的是透析法。透析法所需时间较长，常在低温下
22、进行并加入防腐剂避免微生物污染。透析使用前必须处理，方法是将透析袋置于 0.5mol/LEDTA 溶液中煮 0.5h,弃去溶液,用蒸镏水洗净,置 50%甘油中保存备用。也可用分子筛层析，常用SephadexG-25 柱层析法，上样不要超过床体积的 20%。此外，有些金属离子能和蛋白质形成较为专一的结合而使蛋白质沉淀。这虽不是典型的盐析，但在制备蛋白质中有许多成功的例子。锌离子在特定 pH 下与胰岛素结合形成沉淀就是这种例子。蛋白质从悬浮液中沉淀出来的速度极慢，必须用强力离心来促进这个过程。2、有机溶剂分离纯化法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。有
23、机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。操作时的 pH 值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在 0.05mol 左右, 过多不仅耗费有机溶剂,而且可能导致沉淀不好.沉淀的条件一经确定,
24、就必须严格控制, 才能得到重复性结果.有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示 .故操作条件比盐析法严格。许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。某些第 3 组分的存在可以改变两相的比例和组成。有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶
25、解度小且易变性。疏水层析是近年发展的新方法。它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。此法能分离其它一些方法不易纯化的蛋白质。利用分子形状和大小不同的分离方法蛋白质形状有细长的如纤维，有密实的如圆球，形状很不相同。蛋白质的分子量从 6000 左右开始，有各种大小，大的可以大到几百万。利用这些差别，有几种方法可用来分离蛋白质。凝胶层析：属最常用的蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。所指凝胶从广义上说是一类具有三维空间多孔网状结构的
26、物质，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内加入欲分离的混合物，然后用大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。凝胶过滤是分子筛的一种，在介绍凝胶过滤法之前，首先介绍分子筛的由来。M
27、cBain(1928)提出了分子筛的概念。后来发现这一现象在许多地方都存在。Synge 与 Tiselins（1950）在解释凝胶层中的电泳和电渗现象时引用了分子筛的概念。此后发现在柱层析中也有这种现象，于是许多工作者尝试了一系列适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。至 1959 年 Porath 与 Flodim 找到部分水解的葡聚糖凝胶将其交联，得到了商品名为交联葡聚糖（Sephadex)的分子筛。该分子筛具有许多良好的性能，在蛋白质的分离分析中已被广泛采用。Lathe 与 Ruthven(1956)曾利用分子筛效应测定过分子大小与分子量。Flodin 与 Granath（1961）发现不同
28、分子量的葡聚糖级分，其凝胶过滤行为与分子量大小有关。Andrew（1962）发现蛋白质中也有类似的性质.此后经过不少人的实际应用，完善了这一方法，形成一个可靠的测定高分子分子量的方法。凝胶层析是 60 年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。由于设备简单、操作方便和不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，所以目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用PH 值：与沉淀蛋白质或酶原理相同，结晶的溶液 PH 值一般选择在被结晶的蛋白质或酶的等电点附近，以利于晶体的析出。温度：除少数情况外，通常选择低温条件进行。低温条件对蛋白质和酶不仅溶解度低且不易变性。在中性
29、盐溶液中结晶时，温度可在 0至室温范围内选择，在有机溶剂中结晶一般要求温度较低。 晶种：不易结晶蛋白质和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶结晶可导致大量结晶的形成。有时用玻璃轻轻摩擦容器壁也可达到此目的。需加晶种才能形成结晶的蛋白质或酶，大多数结晶收率都不高。金属离子：有些蛋白质和酶结晶时还需加入金属离子，如铁蛋白在硫酸铵溶液中结晶时，加入少量镉离子才形成菱状结晶，烯醇化酶也常加入汞盐后形成结晶。结晶时间：在结晶条件比较适合的情况下，在几小时甚至几分名即可获得结晶。但有些情况需数天甚至数月才能结晶完全，视各种蛋白质和酶的具体情况不同而定。蛋白质和酶的结晶大多数是针状、棒状、片状，有的为八面体
30、或立方体的菱状结晶。结晶的大小与结晶时间及条件有关。干燥：干燥是将潮湿的固体、半固体或浓缩液中的水分（或溶剂）蒸发除去的过程。根据水分在固体中分布情况可分为表面水分、毛细管水分和被膜所包围的水分3 种。表面水分附着于固体表面，蒸发时完全暴露于外界空气中，干燥最快、最均匀。毛细管水分存在于固体极细孔隙的毛细管中，水分子逸出比较困难，蒸发时慢并需较高温度。膜包围的水分如细胞中被细胞质膜所包围的水分，需经缓慢扩散至膜外才能蒸发最难除去。被干燥的物质其湿度与周围空气的湿度是一个动态平衡关系，暴露于大气中的物质是不会绝对干燥的。若使被干燥的物质所含水分低于周围空气中水分，则必须放在严密封盖的容器中进行干
31、燥。用这种方法可得到含水量极低的干燥样品，生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止变质易于保存和运输，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥，某些无活性核酸、微生物酶制剂和酪蛋白等工业产品则较多地应用喷雾干燥、气流干燥等直接干燥法。真空干燥在相同温度下，被干燥物质所含水分或溶剂由于周围空气压力的降低蒸发速度增加。真空度愈高，溶剂沸点愈低，蒸发愈快。其原理与真空浓缩（或称减压浓缩）相同。真空干燥适用于不耐高温、易氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器、及真空泵 3 部分。干燥器顶部连接一带活塞的管道接通冷凝器，气化后的蒸气由此管道通过冷凝管凝聚，冷凝器另一端连接真空泵，干燥器
32、内常放一些干燥剂如五氧化二磷、无水氯化钙等，以便干燥保存样品。冷冻真空干燥冷冻真空干燥除利用真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同的压力下，水蒸气压随温度的下降而下降。在低温下低压下冰很容易升华为气体。操作时通常将等干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。样品干燥时先在培养皿内铺成薄层（厚度不超过 1cm 的液体），置于低温冰箱内冻固。另在真空干燥器内用两个培养皿分别放置固体氢氧化钠和五氧化二磷，真空干燥上端抽气通过五氧化二磷干燥管与真空泵相连。当放进等待干燥的冻块后，立
33、即封闭干燥器，开动真空泵，红 510h 后得冷冻干燥品。也可将待干燥物质置于圆底容器中，然后浸入干冰-乙醇混合而成的冷却剂中，容器内液体迅速冻成固体，抽真空后等干燥冻块的水分子升华变成气体，经过冷凝器凝结为霜。冰冻的样品逐渐失去水分变成疏松的干燥粉末。上述操作关键在于真空泵的高真空度及管道的口径要合适。喷雾干燥喷雾干燥是将液体通过喷洒装置喷成雾滴后，与干燥介质（通常为热空气）直接接触干燥的方法。由于液体分散为雾滴时，直径通常只有 1200m 大小，与热空气接触面大，水分蒸发很快。在 100的热空气中只需不到 1 秒的时间即可干燥。因干燥时间短和水分蒸发时吸收热量，使液滴及其附近的空气温度较低，
34、故工业上常用。样品贮藏保存：保存方法和生物大分子稳定性有很大关系，生物大分子的贮藏保存可分为干态和液态贮藏两种。但不论是干态或液态贮藏均应避免长期暴露于空气中防止微生物的污染。温度对生物大分子的稳定性影响很大，低温保存在大多数情况下是有利的。干态贮藏：干燥的制品一般比较稳定，如制品含水量很低，要低温情况下物质大分子活性可在数月甚至数年无显著变化。贮藏方法也很简单，只将干燥后的样品置于干燥容器内（内装有干燥剂）密封，保存于 04 冰箱中即可。有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染，可先将样品分装于许多小瓶中，每次用时只取出 1 瓶。液态贮藏液态贮藏的优点是使样品免去干燥这一步骤，生物大分子的
35、生理活性和结构破坏较少；缺点是需要较严格的防腐措施，贮藏时间不能太长，如样品量大时封装运输不方便，实验室常采取少量安瓿封存法。液态贮藏注意事项如下：样品不能太稀，必须浓缩至一定浓度后才能封装贮藏，样品太稀时易引起生物大分子变性作用。一般需加入防腐剂和稳定剂，常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外钙、锌、硼酸等盐溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸与氯化钠的标准缓冲液中。贮藏温度要求较低，大多数在 0左右冰箱保存即可，有的则要求更低温度，但注意某些具有活性的大分子如 DNA 溶
36、液低温保存时，不宜使溶液结冰以免其分子结构被破坏。另有文献报道某些蛋白质和酶在低温中反而引起变性。故应分加情况对待，不能一概而论。总之，生物大分子的贮藏和保存，温度和水分是影响稳定性的两个主要因素。其次，各种稳定剂的应用是否适当关系也很大。实际应用时应全面加以考虑。蛋白质纯度蛋白质提纯以后需要有指标来说明它的纯度，从原则上看有许多制备纯化蛋白质的方法是可以将它们改成分析方法的，如各种分析的电泳、微量凝胶过滤法、各种层析、结晶出现、生物活力及免疫分析等。用一种方法一个条件来分析蛋白质的纯度是不够的。由于蛋白质数量多，性质相似者在所难免，一个条件下两个蛋白质不能分开的可能性是很大的，一般均希望用两
37、种以上的方法来分析蛋白质的纯度。只有一种检定方法时应该用两种以上条件来鉴定。对蛋白质纯度的要求因工作需要而异，生物制品考虑制品体内的副作用，物理化学研究要求不干扰对象的物化性质，化学结构分析要示杂质含量低于分析方法的灵敏度等等均要作具体分析。确定蛋白质（或多肽）样品的纯度标准大致如下。即分子大小是否均一，电荷 是否均一，是否具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的 N 末端和 C 末端残基，进一步纯化时生物活性是否再有提高及能否结晶等，从 N 末端测顺序一般在 4 步以上。如果都是单一的氨基酸残基，则含杂质可能为十六万分之一。上述几条是较严格的要求，很难全都达到。通常以电泳时呈现一条带以及末端残基
38、鉴定是单一的即可进行顺序测定。随着分析技术水平的不断提高，经常还将一种曾认为是纯的蛋白质分离成几个组分，即出现微不均一性（Microheterogeneity ）的现象。这种不均一性可分为两类情况。一类是在蛋白质肽链合成后在加工中产生的，如糖蛋白由于含糖量不同，它们的电泳行为常表现很大差异，又如赖氨酸的甲基化，丝氨酸的磷酰化以及磺酰化等，也会产生电泳行为的不均一性；还有一些则是在分离纯化过程中人为产生的，如脱酰氨等，这种不均一性对蛋白质顺序分析不会带来太大的困难。另一类不均一性是由于基因家族产生的，它们之间的不同表现为个别氨基酸的替换、N 端或 C 端肽段的缺失等，这种不均一性会给蛋白质分析带
39、来很大困难。但蛋白质分子的一部分分子的一个侧链酰基变成了羧基，糖蛋白的配基相差一个单糖，这种情况下蛋白质化学结构仍是单元一蛋白质，生物功能也无任何影响。此外还有同功蛋白质（Isoprotein），它的功能相同但化学结构不同，从功能上看纯了从结构上看不纯。因此，纯度属相对的概念，具体情况要多做具体分析，切不可简单化。技术参数： PH 稳定范围 : 5-9 化学兼容性:与很多盐兼容，比如 CaCl2, (NH4)2SO4；还可与分子生物学及酶学中常用的水溶剂、有机溶剂兼容，比如异丙醇、乙醇和丙酮。 温度抵抗性：可煮沸，可高压灭菌。 蛋白吸附： 每克透析袋吸附蛋白量小于 1ng 储存条件: 透析袋可
40、存放于 10-29 度；每次使用后将余下的膜放回袋子并密封好，以防干裂。 使用前处理： 1. 把透析袋剪成适当长度（10-20cm ）的小段。 2. 在大体积的 2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸 10 分钟。 3. 用蒸馏水彻底清洗透析袋。 4. 放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸 10 分钟。 5. 冷却后，存放于 4 度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。 6. 用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。透析袋的处理分子在半透膜间的分离是由膜两侧溶液的浓度差驱动的，受相对于膜内微孔尺寸的分
41、子大小(分子质量)的限制。微孔尺寸决定着截留分子质量，截留分子质量的定义是当 90%的溶质分子可被膜截留时的分子质量。实际某一溶质的通透性不仅取决于分子的大小，还取决于分子的形状、分子的水化程度及其所带的电荷。这些参数均受溶剂的性质、pH 以及离子强度的影响。因此截留分子质量只能作为参考，而不能绝对地用来预测在各种溶质和溶剂下的透析行为。市售的透析膜孔径范围很大(从 100Da 到 2 000kDa)。在透析大多数质粒 DNA和许多蛋白质时，截留分子质量在 1200014000Da 之间比较适合。(1)将透析管剪成适当长度(1020cm) 的小段，即形成透析袋。(2)在大体积的 2%(m/v)
42、碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸 10 min。(3)将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。(4)将透析袋置 1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸 10min。(5)待透析袋冷却，存放于 4，应确保透析袋始终浸没在液体中。重要：从此步起用透析袋时一定要戴手套操作。(6)在使用之前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。注也可将透析袋放在广口瓶中充满水，松动瓶盖，于 20psi(1.40 kg/cm2)高压灭菌 10min 代替第 4 步用 1 mmol/L EDTA(pH8.0)煮沸 10min 的操作。（1）将透析管剪成适当长度，10-20cm 的小段，即形成透析袋
43、（2）在大体积 2（m/V）碳酸氢钠和 1mmol/LEDTA（PH8.0）中将透析袋煮沸 10min（3）将透析袋用蒸馏水彻底漂洗（4）将透析袋置 1mmol/LEDTA（PH8.0）中煮沸 10min（5）将透析袋冷却，存放于 4 摄氏度，应确保透析袋始终浸没在液体中。重要：从此步起用透析袋时一定要带手套操作（6）在使用前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。 用过的透析袋保存前需要怎么处理？用生理盐水浸泡以去掉蛋白，并用蒸馏水清洗干净，然后置 50乙醇中保存即可；用完以后,要彻底洗干净,透析袋也可以保存在 0.1%叠氮钠（可防止微生物生长）里；0.05%-0.1%叠氮钠，或者 1mM EDTA
44、，或者 50甘油中 4 度保存，公司的人建议前两种保存比较好！3）脱盐常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过 Sephadex G-50 层析柱，以 PBS或 Tris-HCl 缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟 1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于 2% NaHCO3，1mmol/L EDTA 溶液中煮 10 分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋 10 分钟，冷至室温即可使用（并可于 0.2mol/L EDTA 溶液中， 4保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对 50-100 倍体积的 PBS或 Tris-HCl 缓冲液透析（4）12-24 小时，其间更换 5 次透析液，用萘氏试剂（碘化汞 11.5g，碘化钾 8g，加蒸馏水 50ml，待溶解后，再加 20% NaOH 50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。
