1、材料：操作步骤：一、细菌接种将提取到的沙门氏菌菌液取一环在 XLD 培养基上培养，培养一段时间后，从 XLD 培养基上用接种环取一个单菌落接种于三糖铁斜面培养基上，培养一段时间后，从三糖铁培养基上用接种环取一环细菌接种于肉汤培养基上，再进行一段时间的培养。二、细菌 DNA 提取从肉汤培养基中取一定量的菌液装入 EP 管中，离心，去上清，加入双蒸水，沸水浴、冰水浴，离心，取上清。三、PCR（一） 、引物设计1、在 NCBI 上搜索到目的基因，找到该基因的 mRNA，在 CDS 选项中，找到编码区所在位置，在下面的 origin 中，Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用 Prim
2、er Premier5 搜索引物打开 Primer Premier5，点击 File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口， Copy 目的序列在输入框内（选择 As） ，此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击 Primer，进入引物窗口。此窗口可以链接到“引物搜索” 、 “引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击 Search 按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”， “Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在 Search Parameters 里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为 100200bp
3、的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300500bp.点击 OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3不要出现连续的 3 个碱基相连的情况，比如 GGG 或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在 5570 度之间，GC应该在 4555间，上游引物和下游引物的 Tm 值最好不要相差太多，大概在 2 度以下较好。该窗口的最下面列出了
4、两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于 Oligo 来完成，Oligo 自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如 Primer5.在 Primer5 窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后
5、在菜单栏，选择 File-Print-Current pair，使用 PDF 虚拟打印机，即可转换为 Pdf 文档，里面有该引物的详细信息。3、用 Oligo 验证评估引物在 Oligo 软件界面，File 菜单下，选择 Open，定位到目的 cDNA 序列（在 primer 中，该序列已经被保存为 Seq 文件） ，会跳出来两个窗口，分别为 Internal Stability（Delta G）窗口和 Tm 窗口。在 Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5 已经给出）即可，而引物长度可以通过点击ChangeCurrent oligo
6、 length 来改变。定位后，点击 Tm 窗口的 Upper 按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击 Lower 按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用 Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。Analyze 中，第一项为 Key info，点击 Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的 Tm 值，此值 Oligo 是采用 nearest neighbor method 计算，会比 Primer5 中引物的 Tm 值略高，此窗口中还给出引物的 Delta G 和 3端的 Delta G.3端的 Delta G 过高，会在错配位点
7、形成双链结构并引起 DNA 聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过 9。Analyze 中第二项为 Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响 PCR 反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其 Delta G 值应该偏低，一般不要使其超过 4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过 3 个。Oligo 此项的分析窗口中分别给出了 3端和整个引物的二
8、聚体图示和 Delta G 值。Analyze 中第三项为 Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G 值不要超过 4.5kcal/mol，碱基对不要超过 3 个。 Analyze 中第四项为 Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和 Tm 值。上下游引物的 GC需要控制在 4060，而且上下游引物之间的GC 不要相差太大。Tm 值共有 3 个，分别采用三种方法计算出来，包括 nearest neighbor method、 GC method 和 2(AT) 4(G C)method，最
9、后一种应该是 Primer5 所采用的方法，Tm 值可以控制在 5070 度之间。第五项为 False Priming Sites，即错误引发位点，在 Primer5 中虽然也有 False priming 分析，但不如 oligo 详细，并且 oligo 会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在 100 以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到 400500，错误引发效率超过 100 幅度若不大的话，也可以接受。Analyze 中，有参考价值的最后一项是“PCR” ，在此窗口中，是基于此对引物的 PCR 反应 Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另
10、外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于 PCR 反应的二级结构存在，并且 Delta G 值偏大的话，Oligo 在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。引物评价完毕后，可以选择 FilePrint，打印为 PDF 文件保存，文件中将会包括所有Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉 Tm 窗口和Delta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR 窗口。4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行 Blast 分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对
11、上游引物和下游引物的 blast 结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。（二） 、PCR 反应体系优化PCR 标准反应条件： 模板 1pg-1g 引物 1mol/L DNA 聚合酶 15 单位 Mg2 1.5mmol/L dNTPs 200mol/L KCL 50 mmol/L 1. 模板模板可是 PCR 的关键，模板的质量是 PCR 成功的先决条件，巧妇难为无米之炊嘛！怎样得到模板，这可是一个大问题，仅仅一个提取基因组 DNA 就有很多的名堂，这会是我们后面专辑的内容，这里不多说啦，有问题来论坛讨论吧。P 不出东西的时候不妨先考虑：模板有没有问题？（DNA 样品中发现有多
12、种污染物会抑制 PCR。一些在标准基因组 DNA 制备中使用的试剂，如 SDS，在浓度低至 0.01时就会抑制扩增反应。 ）所需的最佳模板量取决于基因组的大小。你的目的片段在基因组中占多少？至少要保证模板中含有一个单拷贝吧！100ng 到 1g 的人类基因组 DNA，相当于 3104 到 3105 个分子。所以对于单拷贝基因,这需要 0.1g 的人基因组 DNA,10ng 的酵母 DNA,1ng 的大肠杆菌 DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的 PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA 中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA 中的杂质也会影响 PC
13、R的效率。 2. 引物引物以干粉形式运输。最好用 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100M。TE 比去离子水好，因为水的 pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。当然，如果担心 TE 对于 PCR 的影响，不妨用 ddH2O。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在 -20。以大于 10M 浓度溶于 TE 的引物在-20可以稳定保存 6 个月，但在室温（15到 30）仅能保存不到 1 周。干粉引物可以在 -20保存至少 1 年，在室温（15到 30）最多可以保存 2 个月。注意：溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1 到 0.5M。
14、较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。3. 聚合酶的选择主要考虑两个方面：用途对保真度的要求高不高？成本高保真的酶总是会贵一些的。综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。Taq DNA 聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少 3到 5外切核酸酶（校正）活性。使用带有 3到 5外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比 Taq DNA 聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大家不妨比较一下。提醒一点：高保真酶除了我所知的 Merck 的 Easy-A 以外，都不会在 3端加 A 尾巴（因为其 3-5外切酶活性） ，所以做 TA 克隆的时候需
15、要一点小诀窍 扩增完了再加普通 Taq 去加个 A。另外还有个方法：将 Taq DNA 聚合酶同带有 3到 5外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独 Taq DNA 聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板。 4. Mg2浓度镁离子影响 PCR 的多个方面，如 DNA 聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP 和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含 200M dNTP 的典型 PCR 起始浓度是 1.5mM（注意：对实时定量 PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液
16、） 。在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。了确定最佳浓度, 可以用 0.1-5mmol/L 的递增浓度的 Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在 PCR 反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或 EDTA 等可能影响 Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适 Mg2+ 浓度。 5. dNTPs高浓度的 dNTPs 会对扩增反应起抑制作用。将每种 dNTP 的浓度从 200M 降低到 25-50M 可以使扩增产物获得满意的产率。 6. KCl标准浓度为 50 mmol/L, 对于较短片段可将其提高到 70-100
17、 mmol/L.（三） 、PCR 反应条件的优化1. 变性：在第一轮循环前,在 94下变性 5-10min 非常重要,它可使模板 DNA 完全解链,然后加入Taq DNA 聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使 PCR 失败,因为未变性完全的 DNA 双链会很快复性,减少 DNA 产量.一般变性温度与时间为 94 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含 GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的
18、损失。2. 退火：这是 PCR 的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从 55到 70。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以 2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5。或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越
19、高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60和 94)完成整个扩增循环 , 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。 3. 延伸：延伸反应通常为 72,接近于 Taq DNA 聚合酶的最适反应温度 75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为 Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从 20-85 .延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA 聚合酶每分钟约可合成 1kb 长的 DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当
20、增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于 DNA 浓度。一般而言 25-30 轮循环已经足够。循环次数过多,会使 PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经 25-30 轮循环扩增后, 反应中 Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够 , 需要进一步扩增,可将扩增的DNA 样品稀释 103-105 倍作为模板 , 重新加入各种反应底物进行扩增 , 这样经 60 轮循环后, 扩增水平可达 109-1010。扩增产物
21、的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C Co(1+P)n 。其中：C 为扩增产物量,Co 为起始 DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。四、DNA 电泳1. 制备 2%琼脂糖凝胶：称取 2.0 g 琼脂糖置于锥形瓶中，加入 100ml1TAE。微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，即成 2%琼脂糖凝胶液。2. 胶板制备：取电泳
22、槽内的有机玻璃内槽(制胶槽) 洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子，将冷却到 65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中添加 1TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止。3. 加样：在点样板上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面
23、。(注意：加样前要先记下加样的顺序)。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压 60-100V，样品由负极(黑色)向正极( 红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时，停止电泳。5. 电泳完毕后，取出凝胶，采用凝胶成像系统拍照保存。五、多重 PCR：DNA 引物：引物的选择遵从简单的规则：引物长度为 18-24bp 或更长， GC 含量为 35%-60% ，退火温度 55 -58 或更高。长些的引物（如 DMD 基因的引物， 28-30bp ）使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特 异性产物。使用软件 Primers 1.2
24、9( 从 ftp.bio.indiana.edu 下载的免费软件 ) 来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。使 用 BLAST 工具在 NCBI 序列数据库中对多对引物进行比对，以检测可能的重复序列。 单基因的 PCR：首先设计了一个分别单独扩增所有基因的 PCR 程序。反应混合物包括： 1xPCR 缓冲液，0.4 M 引物， 5% DMSO 和 1U Taq DNA 聚合酶，共 25 L 反应体积。将在同一台 PCR 仪，在同型号的不同 PCR 仪上，在不同型号 PCR 仪上及在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果进行比较。在同一台 PCR 仪上或在同型号的不同 PCR 仪上扩增，
25、实验的重复性很好，但在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果有明显差异，但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。实验表明对于 100-300bp 的基因扩增产物，通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。对于单一 PCR 反应，退火时间与延伸时间并不明显影响结果，但改变退火温度可以改变 PCR 产物的特异性和产量。对于扩增 22Y 特异基因 (Figure 2a) ，PCR 程序 A 得到最佳结果 (Table 2)。 多重 PCR：等物质量的引物混合物：将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化 (Table 1 和 Figure 2b) 。初次
26、进行多重反应时，各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。结果将会揭示哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变。下面将解释并讨论一些优化的例子，由于许多参数被提及不止一次，因此这些例子并未严格遵照 Figure 1 中所列的步骤。 多重 PCR 反应循环条件的优化延伸温度：Figure 2c 展示了当加入相等量 (0.4 M each) 的四种用于扩增 Y 染色体上不同基因的引物进行多重 PCR 时，用程序 A 和程序 B 扩增得到的结果 (Table 2) ，程序 B 有更高的延伸温度 (72 ) 和更长的退火和延伸时间。总的来说，用程序 A 对 Y-1, Y-3* 和 Y-4 的扩增得到了更高产量
27、的 PCR 产物。此外，用程序 B 扩增时某些产物消失 (Y-1 、 Y-2) ，同时出现了某些非特异性的扩增产物 (Y-1 、 Y-3*) 。程序 B 得到的结果更差一些，表明高的延伸温度减少了某些基因的扩增，尽管我们试图用长的退火时间和延伸时间来消除这种影响。 延伸时间：在多重 PCR 中，由于同时扩增多个基因，酶和 dNTP 的缺乏就成为限制因素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。两个实验表明了延伸时间的影响。在一个实验中，一对 Y 染色体引物 (Y6BaH34pr, 910bp) 被加入 X 染色体引物混合物 (X-3) 中。结果表明 (Figure 3b) ，多重 PCR 中增加
28、延伸时间 ( 程序 A 与程序 D) 可以增加较长的 PCR 产物的产量。在另一个实验中，用程序 C 和 A （ Figure 3a 和 Table 2 ）扩增四个 Y 染色体上的基因。当延长延伸时间时，所有基因的 PCR 产物量都增加了。 退火时间和退火温度：将退火时间从 20 秒改为两分钟并未改变扩增效率，但退火温度却是最重要的参数之一。尽管许多基因能在退火温度为 56 60 被特异的扩增，我们的经验表明 将退火温度降低 4 6 对于在多重 PCR 中扩增出同样的基因是必需的。 Figure 3, df 展示了这种情况，单独扩增时退火温度为 60 的基因在多重 PCR 中退火温度为 54
29、时最优。尽管在 54 时可能出现非特异性扩增（如 Figure 3c ） ，但多重反应中并发的其他基因的特异扩增会消除非特异性扩增的影响。相似的，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。这是由于在 PCR 反应中酶和 d NTP 的供应是有限的，所有的产物都是由同样的一组原料生成。 PCR 循环数：引物混合物 Y-3* 被用于扩增两个不同的基因组 DNA 样品，以不同的循环次数做多次实验 (Figure 4a) 。其中的一个基因组模板质量更高或 DNA 含量更高。可以看出，当循环数增加时，两组样品的各扩增带的产量都逐渐增加。 PCR 产物量增加最明显是在
30、 25 个循环附近。通常对于一个反应， 28 至 30 个循环足矣，增加至 60 个循环对产物量无明显影响。 多重反应中试剂组分的优化当使用同样的扩增程序时，不同的实验间存在差异 (Figures 2c 和 3a) 。解决重复性问题要求调节 PCR 反应组分。 引物的量 ( 步骤 5, B 和 C). 最初，在多重 PCR 反应中使用了相等物质量的引物（每种引物为 0.20.4 M ） (Figure 3c) 。但是扩增并非均一的，即使在优化了循环条件后，某些基因的扩增产物仍不明显。解决这一问题，要求改变反应中各种引物的比例，要增加“弱“ 基因的引物量，而要减少“ 强“基因的引物量。不同基因相
31、对的引物终浓度有明显的差异 (0.040.6 M) ，这完全取决于经验。 dNTP 和 MgCl 2 的浓度：dNTP. 用引物混合物 Y-4 检测了多重 PCR 反应中 dNTP 浓度的影响。氯化镁浓度保持恒定 (3 mM) ，而 dNTP 的浓度从每种 50 M 逐渐增加到每种 1200 M(Figure 4b) 。当 dNTP 浓度为每种 200 M 和每种 400 M 时结果最好，浓度继续增加时扩增被迅速抑制。降低 dNTP 浓度 (50 M) 不抑制扩增，但扩增产物的量会减少。 dNTP 母液对于反复冻融十分敏感，反复冻融 35 次后，多重 PCR 反应常常不能很好进行，扩增产物几乎完全不可见。为了避免这一问题，应分装出小份的 dNTP(25 mM each, 24 L, 1020 次反应 ) ，冻存于 -20 ，使用前离心。 dNTP 的这种低稳定性在单一基因扩增中并不明显。
