1、Comment U1: 像这种数据，最好要有文献标注。Comment U2: 是这些缺点吗？尽量少用“太”或“过” ，这种词比较极端。Comment U3: 标点符号格式不对珠状壳聚糖对茶汤中茶多酚的吸附及解析研究生物与化学工程系 应用化学专业118652009056 苏子达 指导老师 薛丽群【摘要】本论文探讨了在不同条件下珠状壳聚糖对茶多酚的吸附和解析性能。结果表明，在吸附 剂珠状壳聚糖用量 4g、180r/min、吸附时间 4h、茶汤 pH7.5、温度 30、茶汤质量浓度为 1.050mg/mL，珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率可达 80.63 %，在 该条件下壳聚糖对茶多酚的吸附效果最好 ；而
2、用 80%的乙醇作为解析剂、30、180r/min、2h 条件下，对吸附茶多酚后珠状壳聚糖的解析效果较佳。【关键词】珠状壳聚糖、 茶多酚、 茶 汤、吸附、解析。1前言茶，是我国文化与生活中不可或缺的一部分，如今茶文化已经风靡全世界。对茶的种植利用可以追寻至数千年之前，茶树喜欢湿润的气候，在我国长江流域以南地区有广泛栽培。茶作为一种健康的养生饮品收到广泛的推崇，加工后的茶叶冲泡饮用具有强心、宁神、排毒以及抗衰老等等功效 1。是故茶的种植日渐广泛，产量极其巨大，但在茶叶的加工中难免会产生一定量的茶末、碎屑与废弃枝叶之类的废料，而这些废料与大多数的陈茶的利用方法极为有限，经济价值不高，然而陈茶与新茶
3、的主要保健物质（茶多酚）并无区别，若能对陈茶或废料进行深加工，开发一些茶多酚产品，不仅对废弃物进行资源化，还能提高其经济利用价值。本论文实验的目的就在于，对茶叶中于人体有保健功效的主要物质茶多酚的提取。茶多酚为茶叶内所含的多酚类物质的总称，茶多酚在茶叶中的含量一般在 1520，包含有：包括黄烷醇类（儿茶素类化合物）、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类、缩酚 酸 类 多 酚 化合 物 的 复 合 体 和酚酸类等。而其中占据主要成分的为黄烷醇 类化学物质（儿茶素），黄烷醇类化学物质（儿茶素）也是最重要的组成成分，黄烷醇类化学物质儿茶素(C)约占多酚类总量的 60%-80%，它主要的组成成分有 儿茶素(C
4、)、表没食子儿茶素（ EGC）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（ EGCG）、没食子酸(GA)、表儿茶素没食子酸酯（ECG）等 2几种单体。茶叶的许多作用都是因为茶叶中的茶多酚在起作用,它具有：食品保鲜防腐，无毒副作用，食用安全；以及在医学上用于消除活性氧自由基、防癌、防治高血脂血症引起的疾病、提高人体综合免疫能力等等强大功效 3-5。所以茶叶中有效成分茶多酚该如何有效健康的提取，一直是很多人研究和展望的方向。目前较为常见的茶多酚提取方法有：溶剂浸提法、金属离子沉淀法、超临界流体萃取法、树脂吸附分离法、超声波浸提法、微波浸提法等 4。溶液提取法 6-7 主要是将茶叶用极性溶剂浸渍（
5、如丙酮、乙醚、乙醇、氯仿等），然后把浸取液进行液液萃取分离，最后浓缩得到产品，不过此法茶多酚损失太大收率过低生产成本高，且易造成污染。金属离子法是用金属沉淀茶多酚，使其与咖啡碱分离，该法较常用到的金属离子有Ca2+、Fe 2+、Mg 2+、Al 3+、Zn 2+等，相较其它方法而言金属离子沉淀法的选择性和产品纯度均较高,然而在稀酸转溶过程中茶多酚损失较大，且金属离子沉淀剂都具有一定的毒性，此法所生产的产品难以符合食品和医药行业的要求。超临界流体萃取法CO 2 是最常用的超临界流体，相较于以上两种方法，超临界流体萃取法具有萃取温度低、选择性极高、安全无毒等优点，茶多酚在超临界萃取过程中不易氧化，
6、所需产品的纯度高，适合于医药、食品添加剂等产品的要求，然而在超临界CO 2中茶多酚的溶解度小，即使加入极性改性剂后提取率仍然很低，极大的限制了该方法的应用。超声波浸提法 8-9与常规的溶剂浸提法相比，具有提取温度低、生产耗能少、目标产品得率高 、氧化损耗小等特点。曹雁平等 10用双频复合超声提取绿茶中的茶多酚，在浓度、提取率和提取速率方面都优于单频超声法。而微波提取法也是利用物质分子在微波场中的特殊效果 11，减少茶多酚在高温下的氧化，提高产品品质与得率，然而该法对其组分有一定影响。树脂吸附分离法具有工艺简单、操作方便、能耗少 、作条件温和、免了有效成分失活。而且该方法的溶剂乙醇是无毒、无污染
7、、回收容易，所用的吸附剂壳聚糖可再生、成本较低，有利于实现大规模生产。罗志敏 12等进行珠状壳聚糖树脂对绿茶浸出液中茶多酚的吸附，在其最优的实验条件下的吸附率高达74.1%，单位吸附量可达136.1mg/g。壳聚糖是环保型的天然生物材料，来源丰富、无毒、无污染，具有生物可降解性和良好的生物相容性13。壳聚糖树脂微结构具有疏松、多孔性等特性，且表面含有羧基、氨基等功能基团，可以有效的对茶多酚进行提取分离。并且氨基聚合物还可以通过疏水键对茶多酚进行吸附 14，而且通过此法生产的产品使用安全性比较容易有保证，这对医药、食品、化妆品等工业更有特殊的重要性。本论文实验使用珠状壳聚糖对绿茶中的茶多酚进行吸
8、附，并对其吸附条件进行了实验讨论，还对其进行吸附动力学方面的初步探讨。2 实验部分2.1 实验仪器与药品2.1.1 药品与试剂壳聚糖，浙江玉环澳兴生物科技有限公司；甲醇（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；三蒸水；蒸馏水；盐酸，乙酸，硫酸，无水乙醇，酒石酸钾钠，硫酸亚铁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾等均为市售分析纯，乙腈为市售色谱纯。2.1.2 仪器7200 型分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；pHS-3C 型精密酸度计，上海虹益仪器仪表有限公司；88-1 大功率磁力搅拌器， 常州国华电器有限公司；H.H.S 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；TH2-C 台式恒温振荡器，太仓市华
9、美生化仪光厂；DK-S24 型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；prostar-210 高效液相色谱仪，美国瓦里安；SHB- 循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；AUY220 型分析天平，日本岛津；UV-1750 型紫外可见分光光度计，日本岛津；电子万用炉，天津市泰斯特仪器有限公司。2.2 实验内容2.2.1 珠状壳聚糖的制备以 100ml 1%的醋酸溶液溶解 4g 壳聚糖，配制成浓度为 4%的壳聚糖醋酸溶液。以医用注射器将溶液匀速滴于凝结液（20%的 NaOH 与 30%的甲醇以 8：2 的比例混合均匀）中，以得到颗粒大小均匀，形状规整，具有吸附能力的球形壳聚糖，于凝结液中静
10、置一夜，而后水洗至中性，泡于蒸馏水中下保存备用。2.2.2壳聚糖膜对茶多酚的吸附性能研究2.2.2.1茶汤的制备称取 3g 的已研磨成碎屑的茶叶试样（精确到 0.0001g）于 500mL 的锥形瓶中，加入450mL 煮沸的蒸馏水，然后塞上塞子移至沸水浴中浸提 45 分钟（每隔 10 分钟摇动一次），浸提完毕后要立刻趁热减压过滤，并将滤液移入 500mL 容量瓶中，待冷却后用蒸馏水定容Comment U4: 用移液管取溶液，有效数字要准确。是 25.00mL论文相关的地方均要改。Comment U5: 没做。不用列出来。10mML102957A.10ab至刻度，摇匀备用。2.2.2.2 茶多酚
11、的定量方法按 GB/T 83132002方法测定茶多酚的含量。茶多酚（%）= 式中：L 1试液的总量，mL；L 2测定时的用液量，mL；M 0试样的质量，g；m试样干物质含量，%；A 试样的吸光度；1.957用 10mm比色杯，当吸光度等于 0.50时，每毫升茶汤中含茶多酚相当于 1.957mg。2.2.2.3 茶多酚的吸附研究按茶汤的制备方法制得茶汤，分别吸取 25mL，然后按规定测定加入珠状壳聚糖前的茶汤中茶多酚的含量 a，然后取茶汤 25mL于 100mL锥形瓶中，加入适量珠状壳聚糖，置于恒温水浴振荡器（180rpm）中吸附一定时间，再按规定测得珠状壳聚糖吸附后的茶汤中茶多酚的含量 b茶
12、多酚的吸附率 p(%)=2.2.2.4 茶多酚的解析研究吸取 25mL茶汤，在最佳吸附条件下用珠状壳聚糖吸附茶汤。获得吸附后的珠状壳聚糖。并按规定测得被吸附后茶汤的茶多酚的含量 ，加入不同解析剂，置于恒温水浴振荡1器（180r/min）中解析一定时间，再按（2.2.2.2）规定测得解析出来的茶多酚的含量 。1b茶多酚的解析率 p（%）= 0ab12.2.3 HPLC检测条件按 GB/T 8313-2008方法使用液相色谱仪检测。色谱条件：色谱柱，ODS-3 C18色谱柱（4.6 mm i.d.250 mm，5 m） ；流动相A，90mL 乙腈和 20mL乙酸用三蒸水定容至 1000mL；流动相
13、 B，800mL 乙腈和 20mL乙酸用三蒸水定容至 1000mL；柱温为室温；流动相总流速 1mL/min；紫外检测器：=278nm；梯度条件：100%流动相 A保持 10分钟15 分钟内由 100%流动相 A转为 68%流动相 A，32%流动相 B68%流动相 A，32% 流动相 B保持 10分钟100%流动相 A；进样量：20L。原茶汤，吸附后茶汤，解析后茶汤，咖啡因标准液，茶多酚标准液都在此色谱条件下检测。3 结果与讨论3.1珠状壳聚糖对茶多酚的吸附性能研究3.1.1珠状壳聚糖的用量对吸附率的影响取部分用蒸馏水清洗浸泡至 pH为中性的珠状壳聚糖，然后取出用滤纸吸干膜表面水分备用。分别称
14、取 0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、4.0g、5.0g、6.0g 的珠状壳聚糖于Comment U6: 图中最上面那行文字，删掉。横坐标“投加量”改为“珠状壳聚糖用量”Comment U7: 删Comment U8: 删100.0mL干燥的锥形瓶中，分别吸取 25.00mL相同浓度的茶汤。置于 30的恒温振荡器（180r/min）中振荡 2小时。取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率情况，茶多酚的吸附率结果如图 3-1所示，随着珠状壳聚糖 用量的增加，珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率呈上升趋势，但当珠状壳聚糖的量达到 4g后，茶多酚的吸附率基本达到平衡。在本实验条件下，珠状壳
15、聚糖用量为 4.0g。吸 附 剂 投 加 量 对 吸 附 率 的 影 响010203040506070800 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6投 加 量 /g吸附率/%图 3-1 吸附剂投加量对吸附率的影响3.1.2 温度-时间对吸附率的影响平行取 25.00mL质量浓度为 1.049mg/mL的茶汤若干份，分别加入等量的珠状壳聚糖，均分成 4批，分别置于 20、30、40、50恒温振荡器（180rpm）中，吸附不同时间（0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4.0h、4.5h、5h）后，分别取出测定珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率，结果如图
16、 3-2所示。4 组的吸附率都随吸附时间的延长逐渐增大，但吸附 1.5h后吸附率增加都相对缓慢，当吸附时间 2h后，吸附都基本达到平衡，吸附率基本无明显变化，最佳吸附率可达 70.96%。随着时间增加在不同温度下，珠状壳聚糖对茶多酚吸附率基本上是增加的，但在吸附时间 2.5小时之后增加不明显，这说明了在常温条件下，珠状壳聚糖对茶多酚的吸附受温度影响很小。而且茶多酚在空气中易被氧化，所以在珠状壳聚糖吸附茶多酚的过程中，温度 30 提取 2h较佳。Comment U9: 删Comment U10: 这张图最好能再做一条线，用吸附量为纵坐标。不然大家可能有点疑问，为什么吸附率会下降，实际上已经吸附达
17、到平衡，即吸附量是一定的，而茶汤浓度增加，反而显得吸附率下降。00.10.20.30.40.50.60.70.80.90 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5吸 附 时 间 /h吸附率 20 可 见30 可 见40 可 见50 可 见图 3-2 温度-时间对吸附率的影响3.1.3 茶汤浓度对吸附率的影响称取5g研磨成碎末的茶叶配置出茶汤，分别加蒸馏水稀释稀释成20%、40%、60%、80%、100%的茶汤，分别测定茶多酚的含量，再准确吸取25mL 于锥形瓶中，并分别加入4g壳聚糖，置于30，180r/min的恒温水浴振荡器中吸附 2h后取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率情
18、况，茶多酚的吸附率结果如图3-3所示，刚开始，随茶汤溶度的升高，珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率逐渐升高，而当茶汤溶度达到60%的时候，珠状壳聚糖对二者的吸附率同时达到最大值，随着茶汤浓度继续升高，珠状壳聚糖对二者的吸附率又开始降低。因此最佳吸附条件的茶汤溶度应为60% 。茶 多 酚 吸 附747576777879808182838420 40 60 80 100茶 汤 浓 度 /%茶多酚吸附率/%图 3-3 茶汤浓度对吸附率的影响3.1.4 pH值对吸附率的影响平行取 25.00mL相同浓度的茶汤 5份，茶汤 pH值为 5.38，分别用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节 pH至 3.0、4.5、 6.0、
19、7.5、9.0，然后加入等量珠状壳聚糖，置于 30恒温振荡器中（108rpm）吸附 4h，测定珠状壳聚糖对在不同 pH的茶汤中对茶多酚的吸附率。结果如图所示，在 pH=3.00至 7.5范围内，随着 pH升高，吸附率逐渐增大，说明酸性条件下不Comment U11: 最好要有文献标注。Comment U12: 放在后面。放在解析剂确定好之后。Comment U13: 改成“乙醇 ”。酒精是个混合物。我们用的是分析纯的物质，纯度还是很高的。利于珠状壳聚糖对茶多酚的吸附；当 pH7.5后，吸附率又随着 pH增大而减小，这是因为在碱性条件下茶多酚的性质不稳定，容易发生氧化反应，随着溶液碱性的增强，茶
20、多酚的氧化量逐渐增多。因此在本实验条件下，pH=7.5 为较佳的提取 pH值。茶 多 酚 吸 附 率 /%62646668707274767880823 4.5 6 7.5 9pH茶多酚吸附率/%图 3-4 pH值对吸附率的影响3.2 不同解析条件下对于茶多酚解析率的研究3.2.1 解析次数对解析率的影响取 25mL 80%的酒精，加入在最佳吸附条件下吸附过后的珠状壳聚糖，置于 30，180r/min的恒温水浴振荡器中解析 2h后取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的解析率情况，将解析后珠状壳聚糖用滤纸擦干，再用 25mL 80%的酒精在上述条件下解析 2h。反复 4次。茶多酚的解析率结果如图 3-5所
21、示，随着解析次数增加，茶多酚的解析率都有所增加。茶 多 酚 的 解 析 率051015202530354045一 次 二 次 三 次 四 次解 析 次 数茶多酚的解析率/%图 3-5 解析次数对解析率的影响3.2.2 解析时间对解析率的影响吸取 25mL 80%的酒精，加入在最佳吸附条件下 4g吸附后的珠状壳聚糖，置于 30，180r/min的恒温水浴振荡器中解析时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h。取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的解析率情况，茶多酚的解析率结果如图 3-6 所示，随时间的增加，二者解析率有所变动，在2h 后，二者的解析率基本不变
22、。解 析 时 间 对 解 析 率 的 影 响0510152025300.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5解 析 时 间 /h解析率/%图 3-6 解析时间对解析率的影响3.2.3 解析剂的差异对解析率的影响分别取 100%酒精、100%甲醇、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、 0.01mol/L EDTA、0.1mol/L EDTA、水 25mL。加入在最佳吸附条件下获得吸附后的得到的珠状壳聚糖。置于 30，180r/min 的恒温水浴振荡器中解析 2h。取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的解析率情况，茶多酚的解析率结果如图 3-7 所示，由图 3-7 显示可知不同的解析剂解析能力不同，
23、其中酒精对茶多酚的解析能力最佳，但不同解析剂对茶多酚的解析量普遍偏小。而EDTA 做缓冲液时由于 EDTA 的溶解度小的原因，易产生沉淀而无法解析珠状壳聚糖中的茶多酚。茶 多 酚 的 解 析 率0510152025酒 精 甲 醇 缓 冲 液 水解 析 剂茶多酚的解析率/%图 3-7 解析剂的差异对解析率的影响3.2.4 解析剂酒精浓度对解析率的影响分别取 40%、60%、80% 、100% 的酒精 25mL 于 100mL 干燥的锥形瓶中，加入在最佳吸附条件下吸附过后的珠状壳聚糖，置于 30，180r/min 的恒温水浴振荡器中解析 2h。取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的解析率情况，茶多酚的解析率
24、结果如图 3-8 所示，随着酒精浓度的增加，从珠状壳聚糖中茶多酚的解析率随之增高。Comment U14: 要用哪几张图，跟陈辉商量一下。在写这部分的结果与分析，先要从定性的角度，去分析各个出峰所代表的是什么物质，然后再从定量的角度去分析，EGCG 被吸附的量是多少。茶 多 酚 解 析 率051015202540 60 80 100酒 精 浓 度 /%茶多酚的解析率/%图 3-8 酒精浓度对解析率的影响3.3 珠状壳聚糖吸附前后茶汤的HPLC对比分析通过EGCG的标准曲线测定，可知 EGCG的保留时间为14.009min 做得 EGCG的标准曲线如下图 3-9。对图 3-10和图 3-11进行
25、分析，由数据的原茶汤EGCG 的峰面积 33131602；吸附后茶汤 EGCG 的峰面积 897196。EGCG 的吸附率高达97.3%。可以看出珠状壳聚糖对茶多酚具有极强的吸附能力，但对其吸附率十分的小，而珠状壳聚糖对 EGCG具有很强的选择性吸附能力。图3-9 EGCG标准曲线图3-10 原茶汤的HPLC图图3-11 吸附后茶汤的HPLC图Comment U15: 参考文献太老，都没有 2010年之后的文献。要列出几篇出来。4 结论由于珠状壳聚糖的表面含有极丰富的-OH、-NH 2等功能基团, 可通过与茶多酚形成氢键从而达到吸附茶多酚的目的。实验制备了珠状壳聚糖，用其进行吸附分离茶多酚，实
26、验结果表明，对25.00mL质量浓度为1.050mg/mL的茶汤，较佳的吸附条件为珠状壳聚糖加入量4g、吸附时间为2h、茶汤pH 为7.5、温度30 时，茶多酚的吸附率可达到80.63 %。珠状壳聚糖对茶多酚具有选择性吸附分离的性质，特别是对茶汤中的EGCG有选择性吸附。由于壳聚糖在自然界中来源是仅次于纤维素的天然高分子材料，且具有无毒性、良好的生物相容性质、生物可降解性能、易成形和加工等优点，使珠状壳聚糖在茶多酚的吸附分离中必将拥有极其美好的应用前景。5 致谢在长达半年多论文实验及论文的撰写过程中，要十分的感激我们的导师薛丽群的谆谆不倦的指导与督促，同时感谢她对我们的谅解与包容。在实验过程中
27、还得到许多其他老师和同学们的帮助和支持，在此向他们表示衷心的感谢！参考文献1 胥佰涛, 徐平, 沈生荣.茶多酚提取方法研究进展J. 茶叶 ,2007(3):43-46.2 盛 丽,任爱梅.天然抗氧剂茶多酚J. 化学教育,2004,11:8.3 FUJIKI H, SUGANUMA M, IMAI K, et al. Green tea: cancer preventive beverage and/or drugJ. Cancer Lett, 2002, 188(1/2): 9-13.4 郭宇姝, 张沂,朱新生.茶多酚的提取分离与含量测定方法进展 J.解放军药学学报, 2007, 23 (2)
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31、d analytical researchBiological and chemical engineering Applied chemistry specialty118652009056 zida su Guide Teacher: Liqun Xue【 abstract 】 thesis experiment mainly of chitosan under different conditions on the adsorption effect of tea polyphenols, and the analytical results under different condit
32、ions were studied and discussed.Finally the experimental results show that the adsorbent dosage of chitosan beads in 4 g, 180 r/min, adsorption time 4 h, the beverage pH7.5, temperature 30 , mass concentration of 1.050 mg/mL adsorption rate can reach 80.63%.Under the condition of chitosan best adsorption effect of tea polyphenols; And in 80% ethanol, and 30 , and 180 r/min, 2 h under the condition of analytic work best.【 key words 】 chitosan beads, tea soup, adsorption and resolution.
