1、生物大分子的分离纯化由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等） 、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。 1 沉淀法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离
2、纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的 pH 值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。 选择沉淀（热变
3、沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定 pH 值下易变的杂蛋白。 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用 PEG 聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。1.1 中盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析“ 。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，2040饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43饱和度的硫酸铵可以使 DNA 和 rRNA 沉淀，而 tRNA 保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，
4、已有八十多年的历史，其突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。对许多生物活物质具有稳定作用。 中盐沉淀蛋白质的基本原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的COOH、NH2 和OH 都是亲水基团，这些基团与极水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1nm100nm 颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中盐的亲水大于蛋白质和酶分子的亲水，所以加入大量中盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，
5、破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图 21“所示。 中盐的选择常用的中盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。由下表可以看到， （NH4）2SO4 在 0时仍有 70.6的溶解度，远远高于其它盐类：表 21 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100 毫升水）02080100 （NH4）2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893
6、.8101 分离效果好：有滇取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去 75的杂蛋白，纯度提高了四倍。 不易引起变，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用 23mol/L 的（NH4）2SO4 保存可达数年之久。 价格便宜，废液不污染环境。 盐析的操作方法最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离
7、，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，有人经过精心测量，确定出 1 升纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。 盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下
8、：取已定量测定蛋白质或酶的活与浓度的待分离样品溶液，冷至 05，调至该蛋白质稳定的 pH 值，分 610 次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到 610 个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的 pH 缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。盐析的影响因素 蛋白质的浓度：中
9、盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是 2.53.0，相当于 25 mg/mL30mg/mL 。 pH 值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变 pH 值可改变蛋白质的带电质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中盐沉淀蛋白质时，pH 值常选在该蛋白质的等
10、电点附近。 温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在 04下操作，以避免活力丧失。 1.2 有机溶剂沉淀法基本原理有机溶剂对于许多蛋白质（酶） 、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极与其介电常数密切相关，极越大，介电
11、常数越大，如 20时水的介电常数为 80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是 24 和 21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异电荷库仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。有机溶剂沉淀法的优点是：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内
12、沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂） 。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活的大分子容易引起变失活，操作需在低温下进行。 有机溶剂的选择和浓度的计算用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V = V0 (S2 S1) (100S2)式中：V = 需加入 100浓度有机溶剂靛积V0 = 原溶液体积S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓
13、度100 是指加入的有机溶剂浓度为 100，如所加入的有机溶剂的浓度为 95，上式的(100S2) 项应改为 (95S2) 。上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。 有机溶剂沉淀的影响因素 温度： 多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，
14、加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活越高。 样品浓度：样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活的样品易产生稀释变。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常，使用 5mg/mL20mg/mL 的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。 pH 值：有机溶剂沉淀适宜的 pH 值，要选择在样品稳定的 pH 值范围内，而且尽可能选择
15、样品溶解度最低的 pH 值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。 离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过 5为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中盐对蛋白质变有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH 值和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉淀所得的固
16、体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活。1.3 选择变沉淀法这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学质等方面的差异，选择一定吊件使杂蛋白等非目的物变沉淀而得到分离提纯，称为选择变沉淀法。常用的有热变、选择酸碱变和有机溶剂变等。 热变利用生物大分子对热的稳定不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。 表面活剂和有机溶剂变不同蛋白质和酶等对于表面活剂和有机溶
17、剂的敏感不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感强的杂蛋白变沉淀，而目的物仍留在溶液中。使用此法时通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活。 选择酸碱变利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同 pH 值的稳定不同而使杂蛋白变沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。1.4 等电点沉淀法等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两电解质，在达到电中时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分
18、辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。1.5 有机聚合物沉淀法有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )，它的亲水强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为 600020000 的 PEG。PEG
19、的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液 pH 和温度等因素的影响。在一定的 pH 值下，盐浓度越高，所需 PEG 时浓度越低，溶液的 pH 越接近目的物的等电点，沉淀所需 PEG 的浓度越低。在一定范围内，高分子量和浓度高的 PEG沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。由于聚合物有较强的亲水，使生物大分子脱水而发生沉淀。聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。本方法的优点是：操作条
20、件温和，不易引起生物大分子变。沉淀效能高，使用很少量的 PEG 即可以沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。转自清华课件BioLover 2007-5-30 03:30 PM生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自 Thomas Graham 1861 年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大
21、分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液“ ，袋（膜）外的溶液称为 “渗出液“或“ 透析液“。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是 4透析，升高温度可加快透析速度。透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国 Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量 MwCO（即留在透析
22、袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为 MwCO）通常为 1 万左右。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为 23 mm50 mm 不等。为防干裂，出厂时都用 10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活物质有害，用前必须除去。可先用 50乙醇煮沸 1 小时，再依次用 50乙醇、0.01 mol/L 碳酸氢钠和 0.001 mol/L EDTA 溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于 4蒸馏水中，若长时间不用，可加少量 NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用
23、时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。新透析袋如不作如上地殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加 50是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。
24、检查透析效果的方法是：用 1 BaCl2 检查(NH4)2SO4，用 1 AgNO3 检查NaCl、KCl 等。为了提高透析效率，还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设计与制作各种简易的透析装置。美国生物医学公司（Biomed Instruments Inc.）生产的各种型号的 Zeineh 透析器，由于使用对流透析的原理，使透析速度和效率大大提高。3. 超滤超过滤即超滤，自 20 年代问世后，直至 60 年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分
25、离和纯化。 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径地制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于 4104 Pa，膜的平均孔径为 500 埃14 微米（1 微米104 埃） ，用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为 4104 Pa7105 Pa，膜的平均孔径为 10-100 埃，用于分离大分子溶质。反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到 35105 Pa140105 Pa，膜的平均孔径最小，一般为 1
26、0 埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。 超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH 的变化，因而可以防止生物大分子的变、失活和自溶。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。超滤法也有一定的局限，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到1050的浓度。超滤技术的关键是膜。膜有各种不同的类型和规格，可根据工作的需要来选用。早期的膜是各向同的均匀膜，即现在常用的微孔薄膜，其孔径通常是 0.05mm 和 0.025mm。近几年来生产了一些各向异
27、的不对称超滤膜，其中一种各向异扩散膜是由一层非常薄的、具有一定孔径的多孔“皮肤层“ （厚约 0.1mm 1.0mm ） ，和一层相对厚得多的（约 1mm ）更易通渗的、作为支撑用的“海绵层“ 组成。皮肤层决定了膜的选择，而海绵层增加了机械强度。由于皮肤层非常薄，因此高效、通透好、流量大，且不易被溶质阻塞而导致流速下降。常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在 pH 114 都是稳定的，且能在 90下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用 12 年。暂时
28、不用，可浸在 1甲醛溶液或 0.2 叠氮化钠NaN3 中保存。超滤膜的基本能指标主要有：水通量（cm3/(cm2h)） ；截留率（以百分率表示） ；化学物理稳定（包括机械强度）等。超滤装置一般由若干超滤组件构成。通常可分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的 Milipore 公司和德国的 Sartorius 公司。国内主要的研究
29、机构和生产厂家是：中科院生态环境研究中心、杭州淡化和水处理开发中心、兰州膜科学技术研究所、无锡化工研究所、上海医药工业研究所、天津膜分离工程研究所、北京化工厂、常熟膜分离实验厂、无锡市超滤设备厂、无锡纯水设备厂、天津超滤设备厂、湖北沙市水处理设备厂等。从膜的品种，以及从某些研究工作的深度方面看，我国与世畀先进国家的差距不很大，但在膜的质量能及商品化方面尚有较大差距。 在生物制品中应用超滤法有很高的经济效益，例如供静脉注射的 25人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铵耗量大，能源消耗多，操诈时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，平均回
30、收率可达 97.18；吸附损失为 1.69；透过损失为 1.23；截留率为 98.77。大幅度提高了白蛋白的产量和质量，每年可节省硫酸铵 6.2 吨，自来水 16000 吨。超滤技术的应用有很好的前景，应引起足够的重视。4. 冰冻干燥冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。 冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明，见图 6 ：图 23 三相点相
31、图图中 OA 是固液曲线，OB 是汽液曲线，OC 是固汽曲线，O 是三相点。当温度在三相点 O以下，将压力降至 OC 线以下，溶剂（通常是水）就可以由固相直接升华为汽相。例如，冰在40时其上方的蒸汽压为 0.1 毫米汞柱 mmHg，在60时其上方的蒸汽压为 0.01毫米汞柱 mmHg。固态的冰升华为水蒸汽时要吸收大量的热，1 克 0的冰变成 0的蒸汽需吸热 580 千卡，所以升华时又可以使固态的冰进一步降温，空气潮湿时可以看见装有固态冰的容器外壁上结有霜。冰冻干燥得到的生物大分子固体样品有突出的优点：由于是由冰冻状态直接升华为汽态，所以样品不起泡，不暴沸。得到的干粉样品不粘壁，易取出。冰干后的
32、样品是疏松的粉末，易溶于水。 冰冻干燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变的生物大分子，如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。对于极个别的在冻干时易变失活的生物大分子则要十分谨慎，务必先做小量试验证明冻干无害后方可进行大量处理。冰冻干燥机的国产品牌近年来发展很快。如北京的军事医学科学院生产的小型、中型和大型工业用冰干机，已可以取代昂贵的进口产品。在实验室中还可以自已组装小型简易的冰冻干燥器。准备一个较大的玻璃真空干燥器，将样品置于小培养皿中速冻后放入干燥器内，器内已事先用两个小培养皿分别盛有 KOH(或 NaOH) 和 P2O5，干燥器通过一个两端塞上棉花其中装满
33、 P2O5 的干燥管与真空泵相连，抽真空后，经过 510 小时就可以得到冰冻干燥的样品。将样品溶液置于一个园底烧并内，将烧并浸入干冰乙醇低温浴（60）中，样品即被速冻成冰块，将烧并标准磨口通过磨口管与一个冷阱相连，冷阱内放有干冰乙醇混合液，冷阱的另一个出口管与真空泵相连，抽真空时汽化的水汽就冻结在冷阱的内壁上，抽真空数小时后即可在烧并中得到冻干的样品。此简易装置也可用于冻干含有少量乙醇、甲醇、丙酮等常用有机溶剂的样品，可重复以下的操作除去这些有机溶剂：样品速冻抽真空至恒定使样品升温至室温挥发有机溶剂再速冻样品，如此反复多次，以除尽有机溶剂，否则样品不易冻干，且泵前应装有保护真空泵的缓冲并，以吸
34、收水份和有机溶剂。 冰冻干燥操作虽然十分简单，但以下的注意事项却必须认真记取：样品溶液：样品要溶于水，不含有机溶剂，否则会造成冰点降低，冰冻的样品容易融化，因而减压时会起大量泡沫，使样品变、污染和损失。同时若含有有机溶剂，被抽入真空泵后溶于真空泵油，使其可达真空度降低而必须换油。样品要予先脱盐，不可使盐浓度过高，否则冰冻后易融化，影响样品活，而且不易冻干。样品缓冲液在冰冻时 pH可能会有较大变化，例如 pH 7.0 的磷酸盐缓冲液在冰冻时，磷酸氢二钠比磷酸二氢钠先冻结，因而使溶液 pH 下降而接近 3.5，使某些对低 pH 敏感的酶变失活，此时需加入 pH 稳定剂，如糖类和钙离子等。样品溶液的
35、浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于 15 mg/mL 为宜。同批冻干的样品液浓度不宜相差太大，以免冻干的时间相差过大。装样品溶液的容器：最好用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，以免冻干时间太长，耗电太多。也可以使用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超过2 cm，否则烧杯易冻裂。冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否则会影响冻干速度。溶液冰冻：如有条件，尽可能用干冰乙醇低温浴速冻，如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转形成很薄的冰冻层，则可以大大加快冻干的速度。冻干：样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。样品冻干达到较高真空度时，容器外部有时会结霜，若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延长冻干时间即可。冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下仃留时间过长而失活。仃真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油，通常半年或一季度至少要换一次油。
