1、光遗传学技术与光起搏：心电生理研究中的新手段 摘要 光遗传学是 2006 年提出的一个将光控技术和遗传学技术相结合的新概念，以遗传学技术将光敏感蛋白表达于可兴奋的靶细胞或靶器官上，利用相应波长的光照激活光敏感蛋白以实现对细胞、组织、器官及动物生理功能的精准调控。该技术于 2010 年被引入心电生理研究，有离体及在体实验证实利用光遗传学技术实现光起搏心脏的可能性。研究表明光照刺激可引起心肌细胞电兴奋、恢复心肌细胞电传导、实现心脏再同步化，甚至可以模拟缓慢性、快速性心律失常。随着光敏感蛋白种类与功能的发掘、其转入心肌细胞方式和锚定心脏靶点多样化的研究，及安全便捷的光照条件和设备的研发，光遗传学技术
2、与光起搏将成为临床心电生理研究及心律失常治疗等的重要新手段。 关键词 光遗传学 光起搏 光遗传学（optogenetics）这一概念由 Deisseroth 等于 2006 年首次提出1 ，是指一种将光控技术和遗传学技术相结合用以进行细胞生物学研究的新技术，即将光敏感的离子通道蛋白表达于可兴奋的靶细胞或靶器官上，利用相应波长的光照激活光敏感通道以实现对细胞、组织、器官及动物生理功能的精细调控。光遗传学技术原理的最初应用源于 2002年 Zemelman 等将光敏感蛋白导入靶细胞进行神经活动的研究2，此后光遗传学技术在大脑神经环路、神经功能调控的研究中得到了迅速发展，并于 2011 年被Natu
3、re Methods杂志评为 2010 年度技术3。2010 年 Arrenberg4和 Bruegmann5先后将光遗传学技术引入斑马鱼及转基因小鼠的心脏节律控制研究，使光遗传学技术成为了心电生理研究的一个新手段6-10 。本文拟就光遗传学技术及其在心脏电生理研究中的现状与前景介绍如下。 一、 光遗传学技术的原理与实施 光遗传学技术转化应用的原理是以特定波长的外源光照射（刺激）激活或抑制表达在哺乳动物细胞或体内的光敏感蛋白，因光敏蛋白活性的改变进而调控靶细胞生物学行为，因此光敏感蛋白是该技术中一个至关重要的元件。光敏感蛋白是一类发现于单细胞微生物如绿藻、单胞菌的视蛋白（Opsin） ，目前最
4、常用的是来源于绿藻（Chlamydomonas reinhardtii）的光敏感蛋白视紫红质通道蛋白 2（channelrhodopsin-2，ChR2 ）11,12 。ChR2是一种光敏感电压依赖性的非选择性阳离子通道蛋白，含 737 个氨基酸，有 7 个跨膜区域，其中第 1、2、3、7 跨膜区为导电孔。ChR2 可被波长 350550nm 的光活化，中心激活波长为 470nm。ChR2 对阳离子的选择强度依次为 H+、Na+、K+、Ca2+ ，其介导的电流呈内向整流特性，反转电位为 0mV，其大小与光源在单位面积的辐照度（irradiance）正相关。因 ChR2 通道快速激活和失活的动力
5、学特性，在经 470nm 蓝光照射时可迅速引发离子流触发可兴奋细胞去极化，进而产生相应电生理效应。其他一些来源于藻类的光敏感蛋白亦被用于不同的光遗传学研究中，包括 CyChR1、CraChR2、MChR1、DChR、VChR1 。VChR1也是一种阳离子通道，可被波长为 589nm 的黄光激活13，如将 VChR1 与 ChR2 同时表达于组织器官上的不同靶细胞，则可用两组不同波长的光照同时调控两类靶细胞。除驱动靶细胞兴奋的光敏感蛋白外，具抑制功能的光敏感蛋白亦必不可少，常用的抑制性光敏感蛋白有 Halorhodopsin（HaloR 、 NpHR）和 Archaerhodopsin-T（Ar
6、chT ）14,15 。NpHR 为氯离子转运视紫红质蛋白，来源于嗜盐碱单孢菌，可被黄光激活，泵入氯离子使细胞膜超极化从而抑制其兴奋性。ArchT 则对红光敏感，为一种抑制性的超极化质子泵。随着各种特性不同、激活波长不同的光敏感蛋白的逐步发现与丰富，利用光照精准调控细胞的光遗传学技术亦得到了迅速发展，使其在多种细胞如中枢神经元、外周神经元、视网膜细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多能干细胞等，多种疾病如成瘾、抑郁、焦虑、自闭等精神疾病、帕金森症、视网膜疾病等的研究与治疗中展示出巨大的潜力。 光遗传学技术要发挥光控效应，需将光敏感蛋白锚定于靶细胞，并建立精准的光照刺激条件，尚有几个重要环节：将一个可高
7、效表达于靶细胞且便于检测的特异性蛋白与光敏感蛋白结合，以病毒、质粒等为载体，通过共培养、微注射、转基因等方式转染光敏感蛋白至靶细胞，给予相应活化波长的光照射（刺激） ，通过调节脉冲光源的强度（light intensity） 、持续时间（light duration） 、频率（flashing rate）提高光敏感蛋白激活后对靶细胞的夺获率（capture efficiency） ，进而改变细胞的生物学行为。 二、光遗传学技术在心电生理研究中的应用 Arrenberg 等于 2010 年将 NpHR 和 ChR2 表达于斑马鱼心肌细胞，分别以 488nm和 561nm 波长的光照，模拟出可逆性
8、的心动过速、心动过缓、房室传导阻滞、心脏骤停4。同年 Bruegmann 等首次将光遗传学技术运用于哺乳动物心电研究，报道了光控调节 ChR2转基因小鼠心脏节律的研究结果，发现蓝光刺激可激活 ChR2 小鼠心肌细胞的内向电流和动作电位，其幅值与光照强度和持续时间有关，而给予在体心脏蓝光刺激时，不同的光照部位、光照面积、光照强度、光照频率均可影响心房、心室电活动，甚至引起心律失常5。Bruegmann 等的报道使利用光遗传学技术开展心电生理研究、心律失常防治、甚至模拟CRT 改善心功能成为可能，使光遗传学技术为起搏心脏提供了一种新手段，即光起搏（Optical pacing） 。 在近 4 年的
9、时间里，光遗传学技术在心电生理研究中的应用逐渐增多。Abilez 等将表达了 ChR2 的人胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞（hESCChR2-CM） ，分别用膜片钳、微电极阵列（MEA）及计算机建模等技术，探讨蓝光刺激对心肌细胞电活动的影响，发现在全细胞电压钳制模式下，光照可引起迅速达到峰值并衰减至平台期的光电流 IChR2，电流大小与光照强度密切相关，而关闭光源电流消失。当给予频率为 0.5、1.0、1.5HZ 的蓝光刺激，MEA 可记录到与光照频率一致的心肌细胞场电位（field potential）及相应的机械收缩。该研究小组进而建立光学起搏心脏（light-paced hearts）的计
10、算机模拟模型，分别构建由 hESCChR2-CM 介导的房室结、双心室光刺激（photostimulation）起搏计算机模型，以此模拟论证了光学起搏的可行性16。此后 Williams 等根据 HEK 细胞表达 CHR2 的电流动力学特性及光照诱发 CHR2 心室肌细胞动作电位特性，建立了相应的计算机模型，并利用计算机模拟研究 CHR2 转染人心房、心室、浦肯野细胞经光照刺激诱发电活动的情况，发现较低的光照辐射值即可兴奋心肌细胞，尤其是浦肯野细胞，描绘出光遗传学技术调控人类心电活动的应用前景17,18。 除病毒、质粒为载体的 ChR2 转染方式外，Entcheva 的研究小组构建了细胞介导模
11、式的 ChR2 转染心肌细胞（CM）的方法19，该小组利用心肌细胞间通过缝隙连接蛋白CX43 形成耦联的特性，建立了“串联细胞单元” （tandem cell unit，TCU） ，即以稳定表达ChR2 和 CX43 的非兴奋细胞 HEK 293 细胞系为供体细胞（donor cell） ，将其与犬心肌细胞、新生小鼠心肌细胞共培养，则供体细胞与心肌细胞间通过 CX43 形成偶联，用双电极膜片钳技术同步记录已耦联的犬心室肌细胞与 HEK- CHR2 动作电位，发现光照刺激可引发心肌细胞产生动作电位，当给予甘珀酸解偶联剂时动作电位逐渐消失，解偶联剂洗脱后光照诱发动作电位恢复。为评价经 TCU 介导
12、的光遗传学技术在心电研究中的可行性，该研究小组设计了一个既可给予电刺激又可给予光刺激的超高分辨率光标测系统（ultrahigh-resolution optical mapping system）用以研究电刺激与光刺激对 HEK- CHR2-CM 电活动的影响，发现同一组细胞，光和电刺激所引起的传导速度、钙瞬变等特点相似，且光刺激使心肌细胞兴奋所需要的强度很低，可有效减少起搏心脏的负效应，认为 TCU 模式有望在将光遗传学引入临床应用中发挥重要作用。 Nussinovitch 等20今年初报道了一篇利用成纤维细胞携带光敏感蛋白ChR2/ArchT 实施光控心肌细胞电活动的研究，从多个角度展开体
13、外实验，揭示了光遗传学在抗心律失常、恢复心室同步化等方面的应用前景。该研究首先构建了以含 ChR2 质粒转染的小鼠胚胎成纤维细胞系（NIH-3T3） ，并利用膜片钳技术证实了 470 nm 的蓝光照射可引起 ChR2-成纤维细胞的内向整流电流，电流的大小与光的强度、持续时间有关，无光照时则无电流。进而该小组利用 MEA 技术观察了将 ChR2-成纤维细胞与原代新生大鼠心肌细胞（NRCMs）共培养时，光照起搏对心肌细胞的夺获效率。发现 MEA 可记录到与蓝光频率一致的心肌细胞场电位，但光起搏对心肌细胞的夺获效率受蓝光的闪烁频率、持续时间、强度等影响。表现为：频率越快夺获效越低，当频率低于 100
14、 次/分时夺获率可达90以上，而频率为 200 次/分时夺获率仅为 568；持续时间缩短则夺获率降低，持续时间大于 25ms 时夺获率达 90以上，反之则起搏夺获降低；在相同的持续时间下，蓝光起搏心肌细胞亦存在阈值，该阈值由光的强度决定，当强度达到起搏阈值时可使 95的细胞兴奋。该研究还证实蓝光起搏同样可以兴奋与 ChR2-成纤维细胞共培养的人胚胎干细胞源心肌细胞（hESC-CM） ，产生与光照频率一致的动作电位。为证明细胞的兴奋是由ChR2 受光照诱发，该研究将 ChR2-成纤维细胞、NRCMs 和未转染 ChR2 的成纤维细胞分别局限于 MEA 培养皿中的不同部位共培养，发现无光照时自发的
15、电兴奋起源于心肌细胞，而蓝光照射后，电兴奋则起源于 ChR2 阳性表达的成纤维细胞区。为明确光遗传学技术能否形成类似 CRT 模式的多点同步激活，该研究小组将 ChR2-成纤维细胞分散培养于NRCMs 中并给予弥散的蓝光照射（diffused blue-light illumination） ，发现心肌细胞在多部位同时兴奋且总体激活时间显著缩短。此外该研究还通过降低 MEA 培养皿中 NRCMs 的密度，建立传导阻滞的体外模型并与 ChR2-成纤维细胞共培养，发现 NRCMs 间不同步的场电位经蓝光照射后恢复了电同步。为明确光遗传学对心电生理的双向调节作用，该小组构建了共同转染 ChR2、Ar
16、chT 的成纤维细胞与 NRCMs 共培养，发现 624nm 的红光照射可使 MEA 记录到的心肌细胞场电位被抑制，而 470nm 蓝光则可起搏心肌细胞。Nussinovitch 等的体外实验让我们看到了在心脏安一个 “光源开关”调控节律的可能性。 今年 Beiert 等的一篇报道将光遗传学在心电生理研究中的调控靶点由细胞膜离子电流扩展至细胞间信号转导21。该研究以一种光敏感的 Gq 蛋白偶联受体黑视蛋白（melanopsin）为光控的工具蛋白，将黑视蛋白以质粒转染小鼠胚胎干细胞，诱发分化为可自发搏动的心肌细胞，给予 470nm 蓝光照射后心肌细胞搏动频率显著增加且与光照强度有关，MEA 记录
17、显示兴奋起源于蓝光照射区并向非照射区传导。为证实光控对心肌细胞的起搏效应基于蓝光对黑视蛋白的激活，继而促进 Gq 蛋白相应信号转导增加细胞内钙循环，该研究在蓝光照射下分别给予磷脂酶 C（PLC ） 、IP3 受体抑制剂干预，发现细胞搏动频率显著降低，而阻断兰尼碱受体则无此效应。该研究能否为光起搏心脏提供新的光敏感蛋白和光控靶点，还有待于更多的实验结果。 三、 光遗传学技术在心电生理研究中的前景 利用光遗传学技术指导下的光起搏可实现对心脏节律、同步收缩等的精准调控，可能成为未来心脏起搏研究的一个非常重要的手段。而光起搏相比电刺激具有更大的优点，如光敏感蛋白可在心脏的靶细胞和靶部位更精准的表达；光
18、敏感蛋白的组合可形成兴奋和抑制的双向调控；光波刺激的幅值低不适反应少等。但将光遗传学技术、光起搏应用于临床还有许多问题需要解决，如心脏能否长期安全有效地表达光敏感蛋白；外源性光照能否安全有效启动光敏感蛋白等。已有体外研究证实光敏感蛋白可经病毒、质粒转染或宿主细胞介导表达于成熟心肌细胞，因此将光敏感蛋白表达于整体心脏对于目前的遗传学技术来说已可以实现，只是在载体选择、干预方式等技术上仍需给出更为适宜的研究数据。将多种光敏感蛋白在整体心脏按需形成异质性地转入，继之以多重光源更精确地调控心脏，将实现心脏多个腔室或多个部位更具针对性的起搏模式，而具抑制特性的光敏感蛋白的精确调控亦可能成为快速性心律失常
19、的一种治疗手段。安全、低创或无创、穿透性及可控性强的光照设备或光导纤维的研发，将为低照射剂量精准调控提供适宜的光起搏设备。当然如果在光敏感蛋白的深入研究中对其结构、特性等进行特异性的变构，则亦可进一步提高光遗传学技术在心电领域中应用的便捷性。 总之，光遗传学技术的应用在维持正常的心电节律，恢复同步的心脏收缩，抑制快速性心律失常等研究中虽然还有许多未解的难题，但其的确将成为一个具有用广阔应用前景的技术。 参考文献： 1. Deisseroth K, Feng G, Majewska AK, et al. Next-generation optical technologies for illum
20、inating genetically targeted brain circuits J. J Neurosci,2006,26(41): 10380 2. Zemelman BV, Lee GA, Ng M, et al. Selective photostimulation of genetically charged neurons J. Neuron,2002,33(1):15 3. Deisseroth K. Optogenetics J. Nat Methods,2011,8(1):26 4. Arrenberg AB, Stainier DY, Baier H, et al.
21、Optogenetic control of cardiac function J. Science,2010,330 (6006):971 5. Bruegmann T, Malan D, Hesse M, et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo J. Nat Methods,2010,7(11):897 6. Abilez OJ. Cardiac optogenetics J. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2012;2012:1386 7. Entcheva E.
22、Cardiac optogenetics J. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2013; 304(9):H1179 8. Ambrosi CM, Entcheva E. Optogenetics promise: pacing and cardioversion by light? J. Future Cardiol.,2014,10(1):1 9. Entcheva E. Fiat lux in understanding cardiac pacing, resynchronization and signalling by way of optogenet
23、ics J. Cardiovasc Res.,2014,102(3):342 10. Boyle PM, Entcheva E, Trayanova NA. See the light: can optogenetics restore healthy heartbeats? And, if it can, is it really worth the effort? J. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2014,12(1):17 11. Nagel G, Szellas T, Huhn W, et al. Channelrhodopsin -2, a directl
24、y light-gated cation-selective membrane channel J. Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(24): 13940 12. G N, Tan A, Farhatnia Y, et al. Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch J. N Biotechnol,2013,30(5):461 13. Zhang F, Prigge M, Beyriere F, et al. Red-shifted optoge
25、netic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri J. Nat Neurosci, 2008,11(6):631 14. Gradinaru V, Thompson KR, Deisseroth K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications J. Brain Cell Biol, 2008,36(1-4): 129 15. Chow BY, Han X, Dobry AS, et al
26、. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps J. Nature,2010, 463(7277): 98 16. Abilez OJ, Wong J, Prakash R, et al. Multiscale computational models for optogenetic control of cardiac function J. Biophys J,2011, 101(6):1326 17. Williams JC, Xu J, Lu
27、Z,et al. Computational optogenetics: empirically-derived voltage-and light-sensitive channelrhodopsin-2 model J. PLoS Comput Biol,2013;9(9):e1003220 18. Boyle PM, Williams JC, Ambrosi CM, et al. A comprehensive multiscale framework for simulating optogenetics in the heart J. Nat Commun,2013;4: 2370
28、19. Jia Z, Valiunas V, Lu Z, et al. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery J. Circ Arrhythm Electrophysiol, 2011,4(5):753 20. Nussinovitch U, Shinnawi R, Gepstein L. Modulation of cardiac tissue electrophysiological properties with light-sensitive proteins J. Cardiovascular Research,2014,102(1), 176 21. Beiert T, Bruegmann T, Sasse P. Optogenetic activation of Gq signaling modulates pacemaker activity of cardiomyocytes J. Cardiovasc Res. 2014,102(3):507
