1、申 报 论 文（ 中 级 ）题目：拉呋替丁的合成工艺及质量研究单位： 华润双鹤药业股份有限公司 姓名： 马昕艳申报专业： （西药）药品分析2015年08月05日I摘 要拉呋替丁是由日本Fujirebio和Taiho公司联合开发的第二代长效组胺H2受体拮抗剂，具有持续的抗分泌作用和潜在的胃黏膜保护作用，2000年首次在日本上市。主要用于消化性溃疡、胃炎、反流性食管炎、胃溃疡、十二指肠溃疡及其它相关症状的治疗。为了确保合成工艺能够得到合格的原料药，对合成中的中间体进行质量研究，采用适当的分析方法和合适的质控限度显得尤为重要。根据对CTD格式申报资料的要求，对关键步骤的中间体的分析方法需提供验证资料
2、，在项目研究方案制定时就设计了较全面的中间体的质量研究工作，本文详述了拉呋替丁的合成和质量研究工作。为了解决原工艺拉呋替丁工艺步骤长、杂质较多的问题，我公司对拉呋替丁采用市售中间体作为起始原料，缩短了工艺，解决了原工艺相应中间产物杂质较多影响产品质量的问题。同时，为考察变更工艺后拉呋替丁质量变化情况，按照“已上市化学药品变更的技术指导原则”对拉呋替丁进行质量研究。经过液相条件的摸索和杂质的分析将液相条件优化为梯度洗脱的HPLC法，保证了有关杂质的有效分离析。对选用的液相法进行了方法学研究，结果表明，该方法准确度和精密度均符合要求，专属性良好，可以作为拉呋替丁的有关物质检查方法。优化后的分析方法
3、及限度经多批实验数据证实能对该中间体进行有效的控制，以保证得到合格的原料药。关键词：拉呋替丁；有关物质；高效液相色谱法目 录摘要I目录2前言11. 合成工艺试验部分11.1 反应式11.2 具体工艺流程22. 质量研究部分32.1 有关物质的研究32.2 有关物质分析方法的选择与验证42.3对硝基苯酚测定方法验证94.分析与结论121前言拉呋替丁（Lafutidine ）化学名为（ (Z)-2-(2-呋喃基甲基 )亚磺酰基-N-4-4-9(哌啶基甲基)-2-吡啶基-氧基 -2-丁烯基 乙酰胺），是由日本Fujirebio和Taiho 公司联合开发的第二代长效组胺H2受体拮抗剂。具有持续的抗分泌
4、作用和潜在的胃黏膜保护作用，2000年首次在日本上市。主要用于消化性溃疡、胃炎、反流性食管炎、胃溃疡、十二指肠溃疡及其它相关症状的治疗 1。在拉呋替丁的合成工艺中，原料药的有关物质控制是关键，因此在中间体的质量研究中主要是对有关物质建立合适的分析方法。当前的法规对CTD申报资料要求列出已分离的中间体的质量标准，并提供必要的方法学验证资料。与之前对申报资料的要求相比，更加明确了中间体质量研究的重要性，为使该品种顺利申报，在对中间体研究的方案设计时就加大了质量研究工作，明确了中间体方法验证的必要性。根据化学药物原料药制备和结果确证研究技术指导原则化学药物治疗控制分析方法验证技术指导原则等相关法规，
5、我们对中间体的质量控制方法及限度进行了研究。本文主要总结了拉呋替丁的中间体的质量分析方法的研究工作。1.合成工艺试验部分1.1 反应式ONNH2CNNH2ONH2CN LF14性 LF-10OOCOHCOH ONNH2CN OOCH3N2 LF-08LF-09. NaOHLF08性性NH2CNONHSOOOI丁丁 丁I丁丁21.2 具体工艺流程1.2.1 N-4-4-（哌啶基甲基）吡啶基-2-氧代-顺-2-烯丁基邻苯二甲酰亚胺（LF-08）的制备将5Kg马来酸盐投入到50L反应釜中，倒入乙酸乙酯20L，机械搅拌，使其悬浮。降温至0-10，滴加10%NaOH溶液搅拌5小时至固体完全溶解。分出水层
6、，有机层用饱和食盐水洗。减压蒸干溶剂，直接用于下一步反应。1.2.24-4-（哌啶基甲基）吡啶基-2-氧代-顺-2-烯丁胺（LF-09）的制备50下用20L乙醇将LF-08溶解，降温至0-15倒入甲胺10L，自然升至室温（20-30）反应 5小时。降温至0-15缓慢倒入10%NaOH溶液（0.5Kg 溶解到3L水中），反应 1hr。减压浓缩溶剂，至基本不再滴出。向反应罐中加入3L饱和氯化钠溶液和 20L乙酸乙酯溶液，搅拌10min，静置，分出水层。有机层用饱和食盐水洗，用无水硫酸钠（1.5Kg）干燥2小时，滤除干燥剂，用1L乙酸乙酯洗滤饼。滴定测得 LF-09 9.14mol，收率92.7%
7、。1.2.3LF-10的制备将上述溶液置于50L反应釜中，搅拌下加入活性酯 2.82Kg，20-30反应3hr 。降温至0-10滴加盐酸溶液（0.8L溶于8L水）。分出水层，用乙酸乙酯提取。水层倒回反应罐，加入乙酸乙酯17L，冰浴0-10滴加氢氧化钠溶液（0.72Kg溶于5L水中）。滴加完反应20min，分出水层，有机层用饱和食盐水洗。50，2Kg无水硫酸镁干燥 2hr，过滤，干燥剂用2L乙酸乙酯洗。滴定得8.4mol，3.62Kg，收率92%。 0-15搅拌析晶5hr。过滤，滤饼用乙酸乙酯（3L、 2L）洗。得粗品3.4Kg 。母液浓缩至2L ，0-15 搅拌析晶 5hr，回收产品0.2Kg
8、。1.2.4重结晶将3.4Kg拉呋替丁粗品用16L乙酸乙酯回流溶解，加入0.17Kg活性炭脱色20min热过滤，用1L乙酸乙酯洗滤饼，滤液倒回20L反应罐，降至0-310析晶5hr ，过滤，用2L乙酸乙酯洗滤饼，得3.06KgII型拉呋替丁，精制率90%，母液浓缩至2L ，回收产品 0.27Kg，待与其他批合并处理。1.2.4转晶将3.4Kg拉呋替丁粗品用16L乙酸乙酯回流溶解，加入0.17Kg活性炭脱色20min热过滤，用1L乙酸乙酯洗滤饼，滤液倒回20L反应罐，降至0-10析晶5hr ，过滤，用2L乙酸乙酯洗滤饼，得3.06KgII型拉呋替丁，精制率90% 。2. 质量研究部分2.1 有关
9、物质的研究我公司选定的工艺路线是以市售的马来酸盐和活性酯为起始原料，其中关键反应步骤，为胺解步骤。我们对胺解过程反应生成的两个中间体（LF08和LF09）进行了分离纯化，并通过核磁共振氢谱、碳谱和质谱进行了结构确证为顺-N-甲基 -N- (4-(4-哌啶基甲基)吡啶基-2-氧代)-2-烯丁基) 邻苯二甲酰胺（LA）和邻苯二甲酰胺二甲胺。从而推测胺解反应按如下机理进行：NNO MeNH2 NNONH2NOO NNOHNOH3CN +LF08 LF09O NHC3O3O丁丁丁ONaONaOHLA MeNH2丁丁缩合步骤的反应过程如下： NH2ONH2CNLF09 OSONO2O NO2HOLF14
10、+ 丁丁NNOHNSOOO+综上所述，合成中可能产生的杂质如表1所示。4表1拉呋替丁生产工艺过程中可能产生的所有杂质杂质名称 杂质结构 杂质来源马来酸盐 ONNH2CNOOCOHCOH.起始原料活性酯（LF-14） OSONO2O起始原料LF-08 NH2ONH2CN胺解步产物LA NN O HNOHNOCH3H胺解步中间产物邻苯二甲酰胺二甲胺 CH3NHOHNOCH3 胺解步中间产物N甲基邻苯二甲酰亚胺 NOOCH3可能杂质邻苯二甲酸 C8H6O4 胺解步产物对硝基苯酚 NO2HO 缩合步产物拉呋替丁在合成工艺变更后，其杂质的情况发生了一些变化。为了能对新工艺中存在的杂质进行全面的检查，需要
11、对有关物质检查的方法进行全面的研究。通过研究验证，采用了梯度洗脱的HPLC法对本品进行有关物质的测定。另外，在这些杂质中，由于对硝基苯酚具有对皮肤有强烈刺激作用和可引起高铁5血红蛋白血症等毒害作用，应该进行严格控制。为了能对其进行准确测定，另行研究了对硝基苯酚HPLC的测定方法。2.2有关物质分析方法的选择与验证2.2.1试验仪器及试剂试验仪器：Waters e2695，2489检测器，2998进样器安捷伦液相色谱仪 1200试剂：磷酸二氢钾 分析纯甲醇 色谱纯乙腈 色谱纯2.2.2色谱条件的选择（1）检测波长的选择分别称取LA 、LF09、LF08马来酸盐和拉呋替丁，用流动相（0.02M磷酸
12、缓冲盐-乙腈（8020）溶解并稀释制成0.1mg/ml的溶液，进行紫外全波扫描，各溶液的最大吸收波长见表2。表2不同溶液的紫外光谱测定结果样品及杂质 最大吸收波长LA 194，217，277LF09 193，217，278马来酸盐 191，221，280拉呋替丁 192，217，278由表2可见，拉呋替丁及相关物质的最大吸收峰比较接近，均约为193nm 、217220nm和278nm附近。根据测定吸收峰应避开流动相中溶剂的末端吸收峰，并应有较高的吸收值的原则，选择检测波长为220nm 。（2）流动相选择以流动相为溶剂，分别配制LA、LF09、马来酸盐、拉呋替丁粗品及拉呋替丁样品的试验溶液，溶液
13、浓度约为0.10.2mg/ml，采用不同的流动相条件，在220nm波长下进行测定，其试验结果如下：6A采用流动相A为甲醇-乙腈-0.2mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（用三乙胺调节pH值至 6.0）(25 1560)，进行各试验溶液的测定。试验结果见表 3。表3采用流动相为甲醇- 乙腈-0.2mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液的测定结果样品及杂质 主峰保留时间（分）溶剂空白 3.33，4.6LA 14.4LF09 4.68马来酸盐 3.67（实际主峰未检出）拉呋替丁 18.3拉呋替丁粗品 9.74（0.52），10.62（0.18）B流动相改变缓冲液浓度和流动相比例，缓冲液（0.02mol/LKH2PO
14、4）乙腈（8020），测定结果见表4。表4 改变流动相测定结果样品及杂质 保留时间（分）溶剂空白 2.169，2.364LA 5.07（95.7）LF09 2.26（98.5）马来酸盐 2.49（实际主峰未检出）拉呋替丁 7.188（99.8）拉呋替丁粗品 7.229（97.2），2.198（1.4），34.3（0.4）7由于起始原料LF8马来酸盐与中间体LF09的极性相差较大，用流动相为等度的色谱条件进行测定，在流动相中乙腈比例较少时，可检测到中间体LF09，但LF8 马来酸盐需超过1小时的检测时间才可检测到；而当加大流动相中乙腈比例时，在拉呋替丁主峰前的杂质不易分离，故对本品的有关物质检查
15、，宜采用梯度的测定方法。C梯度测定方法参考有关文献 2并经多种不同的梯度方法进行比较，最后确定采用表5所示梯度测定方法：表5、拉呋替丁有关物质测定流动相梯度时间 流动相A(%) 流动相B （）0 87 138 87 1320 60 4020.01 87 1325 87 13分别对各杂质及起始原料按上述梯度方法进行测定，对含有马来酸盐、活性酯、拉呋替丁、LA、LF09、邻苯二甲酰亚胺、邻苯二甲酰甲胺、邻苯二甲酸和对硝基苯酚的混合杂质对照品溶液进行测定，并对拉呋替丁粗品（未经精制的样品）进行测定，其结果见表6。表6 梯度测定结果拉呋替丁及相关物质 保留时间（分）（归一化%）溶剂空白 3.09，3.
16、7LA 4.35(94%)邻苯二甲酰胺二甲胺 3.66(97%)N甲基邻苯二甲酰亚胺 19.8(99.88%)LF09 2.08(82.9%)活性酯 3.37（59.55）19.99（39.3%）马来酸盐 3.35（14.6% ）19.0（70.8%）8拉呋替丁 5.46邻苯二甲酸 5.11（99.3% ）对硝基苯酚 19.98（98.9%）粗品 2.23（0.35% ），3.09（溶剂），3.35（0.05% ）， 3.67（0.56%）,5.77（拉呋替丁98.29%），15.74（0.34%）， 19.07（0.28% ）， 19.87（0.01%）从表6可以看出，采用梯度测定方法，拉呋
17、替丁与起始原料及中间体可较好的分离；对粗品的测定结果表明，该方法可以检出各种原料和中间体、副产物杂质。2.2.3专属性按照上述确定的梯度测定的色谱条件，进行专属性试验。取流动相A 、LA、邻苯二甲酰胺二甲胺、N甲基邻苯二甲酰亚胺、 LF09、活性酯、LF08 马来酸盐，邻苯二甲酸、对硝基苯酚和拉呋替丁各适量，以流动相A为溶剂，分别配制各被测物试验溶液（除拉呋替丁溶液浓度为 0.2mg/ml外，其余均约为0.02mg/ml），进行测定。由所测色谱图可见，流动相A 作为空白溶剂，出峰时间为3.09分和3.66分，LA的保留时间为4.35分，邻苯二甲酰甲胺的保留时间为3.66分，邻苯二甲酰亚胺的保留
18、时间为19.86分，LF09的保留时间为2.08分，活性酯为3.37分和19.99分（主峰），LF08马来酸盐的保留时间为3.38分和19.07分（主峰），邻苯二甲酸为5.12分，对硝基苯酚为19.99分，拉呋替丁主峰为5.77分，拉呋替丁与各杂质峰均可较好的分离，各杂质之间也可分离。试验表明，确定的HPLC色谱条件，可以分离各原料及中间体杂质，各杂质与拉呋替丁主峰之间没有干扰。2.2.4最小检出称取拉呋替丁对照品1.9mg置10ml量瓶中，用流动相A 溶解并稀释至10ml，将此溶液稀释100倍，分别进样10l、5l 和3l，测定。经对图谱分析，进样 3l时，信噪比为3，最小检出量为5.7g。
19、92.2.5不同测定方法的比较分别采用等度和梯度两种不同检测方法，对同一样品进行检测比较。取同批拉呋替丁样品（试验样品为130902批稳定性加速6个月，分别用两种不同的测定方法进行测定，测定结果见表7和表8。表7等度法有关物质测定结果杂质1 杂质2 总杂质（% ） 拉呋替丁主峰保留时间（分） 17.67 29.33 18.66杂质含量（%） 0.035 0.066 0.07 -表8梯度法有关物质测定结果杂质1 杂质2 杂质3 总杂质（% ） 拉呋替丁主峰保留时间（分） 5.11 10.37 19.24 18.66杂质含量（%） 0.02 0.07 0.07 0.13 -由测定结果的比较可以看出
20、，采用修订后的测定方法，主峰前的杂质与主峰的分离度比原标准更好；另外，采用等度方法，不能将易溶于有机相的杂质检出，在主峰后只检出1个杂质，而采用梯度的方法，可以测定不同极性的化合物，在主峰后，可检出更多的杂质，梯度测定的方法更为灵敏和准确。2.3对硝基苯酚测定方法验证2.3.1检测波长的确定溶液配制：称取对硝基苯酚5mg，置50ml量瓶中，加乙腈-水（4060）溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml至10ml量瓶中，加乙腈-水（4060）稀释至刻度，摇匀。10取此对硝基苯酚溶液，在190nm700nm波长处进行紫外-可见光谱扫描。试验结果表明，对硝基苯酚的最大吸收波长为316.2nm 。2.3
21、.2专属性试验取0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈（91）溶液为空白溶液，分别取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，注入色谱仪，照上述测定方法进行测定。由色谱图可见，空白溶液对对硝基苯酚的测定没有干扰。2.3.3系统适用性试验量取对照品溶液10l，连续注入液相色谱仪，记录色谱图，以最后6针峰面积计算，RSD应不大于5.0% 。测定结果见下表9：表9系统适用性试验结果序号 1 2 3 4 5 6 平均峰面积 1952 1853 1929 1947 1853 1945 1913RSD%=2.47系统适用性符合要求。2.3.4线性取对照品贮备液，按下表进行稀释，制备线性测定的各对照品溶液。表10
22、线性溶液配制列表序号 1 2 3 4 5 6取对照品储备液体积（ml） 4 4 4 5 4 40稀释体积（ml） 200 100 50 50 25 20浓度（g/ml） 0.01032 0.02064 0.04128 0.0516 0.08256 0.1032按测定方法进行测定。测定结果见表11。表11 线性测定结果序号 1 2 3 4 5 6浓度（g/ml） 0.01032 0.02064 0.04128 0.0516 0.08256 0.1032平均峰面积 367 708 1504 1841 3135 413011y = 40308x - 132.58R2 = 0.996801000200
23、03000400050000 0.05 0.1 0.15 g/ml峰面积试验结果：对硝基苯酚线性范围为0.01g/ml0.1 g/ml，线性方程为y =40308x 132.58，相关系数r0.9984试验表明，对硝基苯酚溶液浓度与峰面积的线性关系良好。2.3.5稳定性试验取对硝基苯酚对照品溶液，分别在0、2、5、22、23、24小时进行测定，测定结果见表12。表12溶液稳定性考察结果时间（小时） 峰面积 相对零时回收率（%）0 1952 1002 1852 94.885 1832 93.8522 1915 98.1623 2026 103.824 1868 95.70稳定性试验表明，对照品溶
24、液在24小时内测定，测定结果未见明显变化，表明溶液在24小时内是稳定的。2.3.6最小定量限和最小检出限定量限的测定：取对照品溶液稀释10倍，按测定方法进行测定，信噪比约为10。检测限测定：取对照品溶液稀释20倍，按测定方法进行测定，信噪比约为3。测定结果见表13。表13定量限和检测限试验结果定量限 检测限峰面积 浓度 信噪比 峰面积 浓度 信噪比12186 10ng/ml 9.6 113 5ng/ml 3.22.3.7重复性试验取同一批拉呋替丁样品（130901批），按检验方法，同时测定6份，测定结果见表14。重复性试验结果，对硝基苯酚含量测定的平均值为0.0012%，RSD为13.1%，重
25、复性良好。表14重复性试验结果序号 1 2 3 4 5 6对硝基苯酚含量（%）0.0014 0.001 0.0013 0.0011 0.0014 0.00132.3.8样品检验取拉呋替丁样品（130901批、130902批、130903批）25mg ，精密称定，置 25ml量瓶中，加流动相A使拉呋替丁溶解，用流动相稀释至刻度，进样 10l ，每份分别进样2针，记录色谱图。测定结果见表15。三批样品测定结果显示，本品中含对硝基苯酚均未超过0.002%。表15拉呋替丁中对硝基苯酚测定结果批号 100901 100902 100903对硝基苯酚含量（%） 0.0012 0.0012 0.00034.
26、分析与结论通过对拉呋替丁合成路线和杂质的分析，通过实验选择并优化了拉呋替丁有关物质的液相分析方法，并对选定的分析方法进行验证。实验结果表明，梯度洗脱的方法有利于有关物质的检测，相关杂质均能被检出并与主成分峰达到完全分离。对硝基苯酚在浓度为0.01g/ml0.1g/ml的范围内线性良好，相关系数r=0.9984。该方法专属性强，简便，准确，灵敏度高，可以作为拉呋替丁中间体对硝基苯酚有关物质的检测方法。通过多批样品的测试，该方法及限度可有效保证拉呋替丁的质量，并得到有关物质项合格的原料药。13对拉呋替丁原料药的合成有关物质分析方法进行了较全面的研究与验证工作，更加符合当前药品审评的要求，也为今后合成原料药的质量研究工作探索新的思路，并为新的工作积累了经验。参考文献1 渡边，大一，小川等. 拉呋替丁的化学构造及其物理化学的性质 J.医药品研究， Vol.26 No.7 (1995) 5245352 上官盈盈，施菁等.高效液相色谱法测定拉呋替丁中有关物质J.中国现代应用药学杂志，2005，22（4）：304306
