1、综合实验（一） 血清蛋白质的纯化与鉴定,三峡大学医学院 生化教研室,蛋白质的分离纯化,蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。目标蛋白质的分离纯化程序主要包括 材料的选择； 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； 蛋白质初步提纯； 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性 较低温度下(04)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。,实验目的,分离血清得到高纯度的白蛋白 对纯
2、化得到的白蛋白进行电泳鉴定,实验内容,第一部分： （本周）采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白 第二部分： （下周）采用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定纯化得到的白蛋白,第一部分,DEAE-纤维素离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）纯化血清白蛋白,本次实验目的,1、分离血清得到高纯度的白蛋白 2、掌握DEAE-纤维素离子交换层析原理与实验操作技术 3、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法,根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力
3、不同进行分离纯化的层析方式。,离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）的基本原理,树脂 O N+(CH3)2 OH-,离子交换剂,离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团） 和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如纤维素，交联葡聚糖，交联琼脂糖等；,纤维素O CH2 COO- Na,基质 电荷基团 反离子,阳离子交换剂,阴离子交换剂,离子交换剂,离子交换剂的选择,考虑因素：1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量,对于两性蛋白而言，结合
4、力取决于其等电点以及溶液的pH值。,cation,zwitterion,anion,A+,A0,A-,pHpI,pH=pI,pHpI,起始缓冲液的选择,原则： 不能与样品发生化学反应，避免使样品变性。 其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合。,洗脱液,指一定离子强度与一定pH值的缓冲溶液 洗脱方法： 改变洗脱液的离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 改变洗脱液的pH 降低待分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式： 阶段洗脱法 梯度洗脱法,人血浆蛋白质的等电点及分子量,0.06mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5）,实验原理,采用DEA
5、E-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白。 血清样品用0.06mol/L醋酸铵缓冲液（pH 6.5）稀释5倍后上柱。在此pH与离子强度时，DEAE-纤维素带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白（pI 4.9）。 带正电荷蛋白质如-球蛋白（pI约7.3），不被吸附故直接流出。用0.06mol/L醋酸铵缓冲液洗脱吸附在离子交换柱上的少量-球蛋白及-球蛋白。 将醋酸铵浓度提高至0.3mol/L，白蛋白被洗脱下来（尚混有少量-球蛋白）。 整个层析过程用紫外检测仪监测流出蛋白组分，用自动部分收集器收集，用记录仪记录整个洗脱过程。,材料与试剂,1、主要材料 pH计、层析柱（1.620cm）、固定架、聚乙烯
6、管（不同规格）、HD-3紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽等。 2、主要试剂 0.06mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） 0.3mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） 1.5mol/L NaCl0.3mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） 3、样品：血清,实验步骤,DEAE纤维素层析柱的准备 （1）酸碱处理：DEAE-纤维素可按0.5mol/L NaOH 0.5mol/L HCl 0.5mol/L NaOH（碱酸碱）程序处理。 （2）装柱：选用短而粗的层析柱（1.6cm20cm。将经上述酸碱处理的纤维素用0.06mol/LNH4Ac缓冲液（pH 6.5）浸泡后
7、装柱，柱床体积约1.6cm6cm。 装柱时应注意装柱均匀，柱床内不得有界面、气泡，表面要平整。 （3）平衡：装柱后接上恒压贮液瓶，用0.06mol/L NH4Ac （pH 6.5）洗涤平衡，流速 1ml/min。,2、DEAE纤维素层析纯化白蛋白 1）上样：将4ml 用缓冲液稀释后的血清样品加入上述已平衡好的层析柱表面，使样品进入柱床内。小心用4ml 0.06mol/L NH4Ac缓冲液洗涤沾在管壁上的蛋白质样品，使其进入床内。 2）穿流峰的洗脱：连接层析系统，继续用0.06mol/LNH4Ac缓冲液（pH6.5）洗脱未吸附到层析柱上的蛋白，直到记录仪基线基本恢复到原始位置。然后将柱中的缓冲液
8、面降至与柱床表面平齐。 3）白蛋白的纯化：改用0.3mol/LNH4Ac缓冲液（pH6.5）洗脱。每管1ml分部收集 (调节部分收集器时间为1min/tube)。合并蛋白质浓度高的2-3管，用于后续蛋白质纯度鉴定。 由于纯化的白蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，收集的蛋白质为肉眼可见的浅黄色液体。 4）再生平衡：改用 1.5mol/LNaCl0.3mol/LNH4Ac缓冲液洗脱，至记录仪基线基本恢复到原始位置后，再用40ml 0.06mol/LNH4Ac（pH 6.5）洗脱平衡即可。,Sample diagram of a gel filtration system with gravity f
9、eed. The safety loop is designed to keep the column from running dry if left unattended.,Safety loop,BSZ-100自动部份收集器结构与使用方法,按“复位”键，仪器自动复位至起点后“报警”，再按“复位”键，仪器自动复位。 设置定时时间： （1）按下“手动/自动”键，使仪器处于“手动”状态。 （2）按“选择”键，设定时间为1min。 自动收集 按“手动自动”键，指示灯亮，仪器处于自动收集状态。,HD-3紫外检测仪使用方法,将波长旋钮旋到280nm. 按下 “电源”开关。 调节“灵敏度”旋钮至“10
10、0”档，调节“光量”旋钮，使检测仪数字显示50左右进行仪器预热。 开启高位槽，使层析柱缓冲液流过检测仪。在“灵敏度”旋钮处于“100”档时，调节“光量”旋钮，使检测仪数字显示为100，即透光率为100。 把“灵敏度”旋到所需档（1A），调节“调零”旋钮，使检测仪数字显示为“0”。 在样品检测过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变“灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。,LM17型记录仪使用说明,1.打开电源开关。 2.调节零位：按“量程/零位”切换按键，当“零位”指示灯亮时，数码管显示为“Po” 。在零位调节状态下，按下“左移”或“右移”按键不放，使记录笔移至所
11、需的零位。 3.选择量程：按“量程/零位”切换按键，当“量程”指示灯亮时，表示当前操作为量程选择，按增加或减少键，选取合适的量程（HD-3紫外检测仪的量程为10mV）。 4.取下记录笔的塑料笔套，压下“抬/落笔手柄”（不要强力按压笔尖，以避免笔尖损坏或变粗）。实验结束后，将塑料笔套套上，以避免墨水蒸发。 5.选择走纸速度：按“启/停”切换按键，当纸速显示数码管闪烁时，此时按“调速”键调节选择走纸的速度。每按一下，数字依次在0.1mm/min至600mm/min之间变化。调节走纸速度为2mm/min，按“启/停”键，数码管不再闪烁时，仪器即开始记录。不记录时按“启/停”键，数码管闪烁，表示停止走纸。,记录紫外检测仪所显示的峰值，在洗脱曲线上标示出所更换的溶液、峰值及各个峰的含义，分析实验结果 绘制实验装置图,下周实验,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳（p41-44) 预习电泳技术（p28-44）；预习电泳仪的使用方法（p114115) 讨论题： 电泳技术的原理、分类及特点等（第二组发言） 本次血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳的原理、方法、注意事项及临床意义（第三组发言）,
