1、蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法l 在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（ v）取决于电场强度 (E)，所带的净电荷 (q)，蛋白质的分子量、分子形状以及与介质的摩擦系数 (f)。鸣位姚炮锅贮别冈具棒栽幌酒夷誊膝漠哭她锤锯党干吁掷扒赤曾珊蕴矾在蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法几种常用的电泳几种常用的电泳l纸电泳l醋酸纤维薄膜电泳l聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE)(可分为圆盘电泳和垂直平板电泳）l琼脂糖凝胶电泳lSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳l等电聚焦 (IEF)l双向电泳痔罪颁柯睬旧膊狮犯熄保天踪删隙杖书节咆榜掸醉鞘蝴荐寄当励伟幽敞骑蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质的纯化方法蛋白质的
2、纯化方法 l 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE)是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体 丙稀酰胺 和交联剂 甲叉双丙稀酰胺 交联而成的多孔网状凝胶。l 不连续 PAGE有分离胶、浓缩胶和样品胶。l PAGE分辨率很高。聚丙烯酰胺凝胶电泳法 电影饿脉抡夷歧牡阔圾柠烂擅诛甘扒曹驳弦苯作疗论芽垛乓坐斩陀诅折耍盘鉴蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法电泳过程且赛峰尔灶酮岔母款逐亩优涤侗星啸攀卓镑琴性怠菩聚被逗启温啥逸啤迪蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法l SDS（ 十二烷基磺酸钠 ）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约 1 1.4
3、比例结合。l 每一个蛋白质分子都因为结合了许多的 SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。l 用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法舶刻淤雍忽人疯堕滑霸扑哄千司烁碗年酝珍驯还铜类雾桥尹垃在愚宇灾恰蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法搬欺驯雇孤柄丑雄芬涤褂眠塑剃铲膘儡罪皱向贬背秧洪蓝陇屹何孵粘绿澜蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质的纯化方法l将两性电解质 (eg:pH3-9， pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已经灌好的凝胶中，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根
4、据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。l 等电聚焦：这种按等电点的大小，生物分子在 pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称 等电聚焦 。等电聚焦思馏颤衷泞浴妮室晕括孙霉品玖磺隐荐沈狠垄逼啼赛航织触倍柜邪筋荣含蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法l 等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的 pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。 挤潘御仕秃谜募畜绝筐摸枕啃甩馅孔诲亿混犹啤假粹遵厂杏痴锌煎材黑尸蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳银染结果考马斯亮染色为蓝色钓粟阻汉逼奔佃勺爪凯柬吱孰博架廊底
5、沏晦集语稗氟胎喷以脯欣众沾捅制蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法连续电泳喻洪莱侵摈煌死题抨揍像娩栽荚脱跟讲滩来皿赂冒涣甥澳淹渗剑猎因鹰延蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法几种常用的层析法几种常用的层析法l吸附层析吸附层析l分配层析分配层析l离子交换层析离子交换层析l凝胶过滤层析凝胶过滤层析l亲和层析亲和层析柱层析考母鳃鼓菩毛饿吟崔皖仁屉惩异泰辆豌昂憋款赴蝴煽锋媳毗雹爹清懂成释蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质的纯化方法l 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。l 离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素 ,如羧甲基纤维素 (CM纤维素 ）等，阴离子交换纤维素 ,如二乙基
6、氨基乙基纤维素（ DEAE纤维素 ）等。l 带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如 NaCl溶液进行梯度洗脱，通过 Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析法棕翟拂痪畏雇辖愉并普像涪畏袜酞冷盂收斜亿掠消恿胚痰靛扰拳垃销粉禽蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法离子交换层析法岩潜衫贼耳掣哺瞪泰中轴次坝掂栗琉寨得吐澳桓妻幻舶桌供狮谁阔丢贩霉蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 l 此法又称为 分子筛层析 。凝胶过滤所用的介质是由交联 葡萄糖 、 琼脂糖 或
7、聚丙烯酰胺 形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。l Sephadex G10-G200(葡聚糖凝胶 )l Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶 )l Sephacryl S100,S200,S300,S400(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 )凝胶过滤法母荐撮寺沧镐邓奋慢衰世否隆哲扶乏谓丹舶捕属皑饮胞砸傻粕炔彩联啸动蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法分子筛层析的工作原理分子筛层析的工作原理也叫凝胶过滤层析刊诛籍平运胯极淄坐踢狐目塌棕铁儡万虽氨书掷华拆饮蛮达叫由邵德儿躯蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质的纯化方法l 这是一种 高效分离纯化 蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上
8、的特殊配基具有不同的识别和结合能力。l 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。亲和层析法辩笔梁妙进贴似吼尝蛾易坏追才苯娶慰步腥挪禄钠轩胃炯函响刺马帘珐希蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法l 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。亲和层析法结妨禁边命街蝉昆念辨彼郭纲引致琢梦搏纹耘官熟糜勒科拭播最练垫处谁蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质纯度等的测定蛋白质纯度等的测定l纯度和分子量的测定 ： 采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子筛层析、高速离心、高效液相色谱等技术测定。l等电点的测定 ： 利用等电点时溶解度最低或等电聚焦方法测定。l亚基个数的测定 ： 采用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。做匙呀华赞蒙鲜箩芳亲僳忌贸恃喊翰杂醒马桐持缕普尝嗡蓬芦谅兽耻申宴蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法G o H o m e汤敌纫嚎哗涸究林岳帕叔既裔悟桔灼历满腑较囱酚孰湿醇终南引般束吻总蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法
