1、GE Healthcare 蛋白质纯化 手册 imagination at work Antibody Purification Handbook 18-1037-46 The Recombinant Protein Handbook Protein Amplification and Simple Purification 18-1142-75 Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatograph
2、y Principles and Methods 18-1022-29 Hydrophobic Interaction Chromatography Principles and Methods 18-1020-90 Gel Filtration Principles and Methods 18-1022-18 Handbooks from Amersham Pharmacia Biotech Reversed Phase Chromatography Principles and Methods 18-1134-16 Expanded Bed Adsorption Principles a
3、nd Methods 18-1124-26 Chromatofocusing with Polybuffer and PBE 18-1009-07 Microcarrier cell culture Principles and Methods 18-1140-62蛋白质纯化 手册前言6 第一章 纯化策略- 一个简单的方法 7 样品准备 8 三步纯化策略 8 蛋白质纯化的总体指导原则 .10 第二章 样品准备 .11 纯化开始之前 11 样品的提取和净化 14 第三章 三步纯化策略 .17 原理 17 纯化技术的选择组合 .18 样品状态 24 第四章 捕获 26 第五章 中度纯化 34 第六
4、章 精细纯化 37 第七章 蛋白纯化策略的例子 .41 重组酶的三步纯化 41 重组抗原结合片段的三步纯化 .45 单克隆抗体的两步纯化 50 膜内蛋白质的一步纯化 .53 目 录第八章 储存条件 55 提取和净化步骤 .56 第九章 纯化技术的原理和标准条件 65 离子交换 (IEX) 65 疏水性相互作用 (HIC) .71 亲和作用 (AC) 76 凝胶过滤作用 (GF) .78 反相作用 (RPC).82 膨胀床吸附作用 (EBA) 856 7 前言 蛋 白 质 纯 化 技 术 和 方 法 的 进 展 一 直 是 推 动 生 物 技 术 进 步 的 最 基 本 的 前 提 条 件 。
5、本 手 册 为 顺 利 进 行 蛋 白 质 的 纯 化 提 供 了 一 些 建 议 和 例 子 。 蛋 白 质 纯 化 方 式 多 种 多 样 ， 从 简 单 的 一 步 沉 淀 操 作 到 大 规 模 的 有 效 的 生 产 过 程 。 经 常 采 用 一 步 以 上 的 纯 化 步 骤 达 到 想 要 得 到 的 纯 度 。 对 蛋 白 质 进 行 成 功 有 效 的 纯 化 的 关 键 是 选 择 最 适 宜 的 纯 化 技 术 ， 优 化 它 们 的 操 作 过 程 来 满 足 所 要 求 达 到 的 纯 度 ， 并 且 将 它 们 以 合 乎 逻 辑 的 方 式 组 合 起 来 ，
6、使 用 最 少 的 纯 化 步 骤 达 到 蛋 白 质 产 量 的 最 大 化 。 大 部 分 的 纯 化 方 案 都 包 含 一 些 色 谱 技 术 。 因 此 作 为 研 究 结 果 ， 色 谱 技 术 在 那 些 需 要 进 行 蛋 白 纯 化 的 实 验 室 里 已 经 成 为 了 一 个 基 本 的 工 具 。 不 同 的 色 谱 技 术 有 不 同 的 选 择 性 ， 它 们 可 以 形 成 强 大 的 组 合 来 纯 化 任 何 活 质 分 子 。 重 组DNA 技 术 的 发 展 使 蛋 白 质 的 产 量 得 到 很 大 的 提 高 。 重 组 蛋 白 的 制 备 经 常 以
7、 方 便 后 续 的 色 谱 纯 化 的 形 式 存 在 。 然 而 ， 这 仍 然 不 能 解 决 所 有 的 问 题 。 宿 主 污 染 问 题 仍 然 存 在 ， 与 样 品 的 可 溶 性 ， 蛋 白 结 构 的 完 整 性 和 生 物 活 性 等 的 相 关 问 题 仍 然 存 在 。 尽 管 在 纯 化 过 程 中 可 能 需 要 考 虑 大 量 的 参 数 ， 但 是 按 照 一 些 简 单 的 指 导 原 则 和 应 用 三 步 纯 化 策 略 ， 仅 仅 需 要 了 解 一 些 色 谱 技 术 基 础 知 识 的 细 节 ， 就 可 以 使 整 个 纯 化 过 程 能 够 简
8、 单 容 易 的 设 计 和完成。 建议符号: 对于纯化的一般建议 大规模纯化的建议 小规模纯化的建议 捷径 对于介质选择的建议6 7 第一章 纯化策略 一个简单的方法 应 用 系 统 化 处 理 方 法 来 研 究 纯 化 策 略 。 第 一 步 是 描 述 基 本 的 纯 化 方 案 。 一 般 需 要 考 虑 回 答 的 问 题 ， 例 如 ： 制 备 产 品 的 目 的 是 什 么 ？ 什 么 样 的 原 材 料 是 可 以 使 用 的 和 如 何 处 理 它 ？ 纯 度 问 题 与 材 料 的 来 源 有 什 么 样 的 关 系 ， 和 终 产 品 的 预 期 使 用 由 什 么 联
9、 系 ？ 什 么 东 西 必 须 去 除 ？ 什 么 东 西 必 须 完 全 去 除 ？ 最 终 纯 化 的 规 模 是 什 么 ？ 如 果 需 要 扩 大 规 模 ， 用 已 选 择 的 纯 化 技 术 将 会 产 生 什 么 样 的 后 果 ？ 在 经 济 方 面 的 限 制 是 什 么 ？ 什 么 样 的 资 源 和 设备是可以利用的。 多 数 纯 化 步 骤 需 要 经 过 一 步 以 上 的 方 法 来 达 到 预 期 想 要 的 产 品 纯 度 。 这 包 括 任 何 需 要 改 变 样 品 条 件 的 限 制 性 步 骤 ， 即 将 产 品 从 一 种 纯 化 技 术 转 移 到
10、 另 一 种 适 合 于 进 行 下 一 步 纯 化 操 作 的 状 态 ， 这 一 过 程 中 的 每 一 步 都 将 会 导 致 产 物 的 丢 失 。 例 如 ， 假 定 每 一 步 能 够 获 得80% 的 产 量 ， 那 么 如 图1 所 示 ， 经 过8 个 纯 化 步 骤 后 ， 总 产 率 将 被 减 少 到 仅 仅20% 。 因 此 ， 使 用 最 少 的 步 骤 和 最 简 单 可 行 的 设 计 来 达 到 预 期 的 产 量 和 纯 度 ， 增 加 步 骤 是 无 效 的 ， 除 非 已 经 完 全 满 足 了 纯 化 所 需 要 达 到 的 产 量 。 在 某 些 特
11、 殊 的 情 况 下 ， 通 过 简 单 的 增 加 重 复 步 骤 就 可 以 很 容 易 使 样 品 达 到 可 以 使 用 的 纯 度 。 但 是 经 验 表 明 ， 即 使 是 那 些 最 具 挑 战 性 的 样 品 纯 化 ， 高 纯 度 和 高 产 量 的 制 品 也 是 可 以 通 过 恰 当 的 选 择 并 有 效 的 组 合 少 于 四 步 的 纯 化 步 骤 高 效 率 的 完 成 。 各 种 技 术 应 该 以 逻 辑 的 顺序组合起来，避免改变样品条件的步骤，恰当的选择色谱技术使纯化步骤尽可能的少。 在纯化过程中限制纯化步骤数8 9 10 80 60 40 20 0 1
12、 2 345678 95% / step 90% / step 85% / step 80% / step 75% / step (%) 图.1. 多步骤纯化的产量。 样品制备 为 了 高 效 、 经 济 的 获 取 足 够 纯 度 和 数 量 的 蛋 白 ， 我 们 可 以 使 用 每 一 种 纯 化 方 法 。 设 定 纯 化 物 的 纯 度 、 数 量 和 维 持 生 物 活 性 和 限 定 经 济 的 框 架 和 工 作 时 间 框 架 是 非 常 重 要 的 。 所 有 涉 及 到 目 标 蛋 白 的 特 性 和 污 染 物 的 信 息 都 会 对 纯 化 的 进 展 有 所 帮 助
13、 的 。 用 一 些 简 单 的 实 验 来 反 映 样 品 和 目 标 分 子 的 特 性 是 一 个 非 常 好 的 方 式 。 随 着 纯 化 技 术 的 进 展 和 评 价 纯 化 效 果 的 需 要 ， 发 展 快 速 的 和 值 得 信 赖 的 分 析 方 法 是 最 非 常 重 要 的 。 样 品 的 制 备 和 提 取 过 程 的 发 展 应 该 优 先 于 使 用 色 谱 技 术 进 行 第 一 步 纯 化 。 在 有 样 品 背 景 信 息 的 情 况 下 ， 分 析 样 品 和 样 品 制 备 步 骤 可 以 放 在 三 步 纯 化 策略中考虑。 三步纯化策略 想象纯化样
14、品要经历三个阶段，样品捕获，中度纯化和样品的精细纯化。 在三步纯化策略中特定的目标物在纯化过程中的每一步都要进行分配。 在目标物捕获阶段，样品经过分离、浓缩并且对目标物进行稳定化处理。 在中度纯化阶段，样品中大量杂质被去除，例如其它的蛋白和核酸 、内毒素和病毒。 在样品精细纯化阶段，通过去除任何残留的微量杂质或者密切相关的物质来达到较高的纯度。 选 择 和 优 化 组 合 纯 化 技 术 对 于 样 品 的 捕 获 、 中 度 纯 化 和 样 品 的 精 细 纯 化 是 非 常 关 键 的 ， 确 保 快 速纯化方法的研制，在更短的时间里完成产物的纯化并且实现经济节约的目标。8 9 最 终 的
15、 纯 化 过 程 应 该 包 括 样 品 的 制 备 ， 当 需 要 时 应 该 有 样 品 的 提 取 和 净 化 ， 接 下 来 是 三 种 主 要 的 纯 化 步 骤 理 想 的 组 合 在 一 起 ， 如 图2 所 示 。 纯 化 的 步 骤 数 主 要 依 赖 于 对 纯 度 的 要 求 和 蛋 白 最 终 的使用目的。 Step Purity 图. 2. 样品制备和三步纯化策略。10 11 蛋白质纯化的指导原则 在 这 里 所 示 的 蛋 白 质 纯 化 指 导 原 则 可 以 被 用 于 任 何 纯 化 过 程 ， 并 且 可 以 作 为 如 何 系 统 化 处 理 样 品 的
16、建 议 ， 用 来 研 制 任 何 有 效 的 纯 化 策 略 。 作 为 一 个 提 醒 ， 这 些 纯 化 方 法 将 在 下 面 适 当 的 章 节 进行重点强调。 明确目标 对 于 纯 化 样 品 ， 明 确 最 终 产 品 需 要 达 到 的 纯 度 、 活 性 和 产 量 要 求 ， 要 避 免 过 度 纯 化 或 者 使 用 的 纯化不够，达不到要求的纯度。 明确需要纯化的目标蛋白质的特性和关键的杂质 对纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。 发展检测分析技术 能够快速的检测蛋白质的活性/回收率和关键的污染物。 使每一阶段处理的样品最小化 避免过多的处理步骤，过多的处
17、理步骤有可能会损失样品活性/降低回收率。 尽可能少地使用添加剂 可能需要额外的纯化步骤去除添加剂，否则添加剂可能会干扰样品的活性分析。 尽早去除对样品有损伤的杂质 例如，蛋白酶 在每一步纯化过程中使用不同的纯化技术 充分利用样品的特性对样品进行分离纯化（样品大小、电荷、疏水性、配基 的特异性） 使用的纯化步骤尽可能少 额外的纯化步骤将会减少目标蛋白的产量和增加纯化时间，要合乎逻辑的组合纯化步骤。 保持简单化 ！10 11 第二章 样品准备 实验开始之前 为 了 能 够 有 效 的 、 经 济 的 获 取 足 够 纯 度 和 质 量 的 某 种 蛋 白 质 ， 使 用 任 何 有 效 的 纯 化
18、 方 法 ， 从 样 品 的 制 备 到 富 集 蛋 白 ， 从 提 取 样 品 为 了 获 取 样 品 的 生 物 化 学 特 性 到 大 规 模 生 产 治 疗 性 重 组 蛋 白 。 设 定 目 标 蛋 白 要 求 达 到 的 纯 度 和 产 量 的 目 标 ， 维 持 生 物 活 性 和 以 钱 和 时 间 方 式 来 衡 量 的 纯 化 过 程 的 经 济 性 ， 是 非 常 重 要 的 。 对 纯 度 的 要 求 必 须 要 考 虑 原 料 的 性 质 ， 最 终 产 品 的 预 期 使 用 目 的 和 特 殊 的 安 全 问 题 。 例 如 ， 区 分 那 些 必 须 要 去 除
19、 的 杂 质 和 可 以 忍 受 的 杂 质 是 非 常 重 要 的 。 其 它 因 素 也 能 影 响 物 质 的 优 先 次 序 。 高 产 量 通 常 是 关 键 目 标 ， 但 是 对 于 那 些 样 品 很 容 易 获 得 或 者 那 些 仅 需 要 很 少 数 量 的 产 物 ， 追 求 高 产 量 就 不 是 那 么 关 键 了 。 在 缺 少KTA 设 计 色 谱 系 统 资 源 的 条 件 下 ， 要 求 多 方 面 纯 化 方 法 的 进 展 或 许 是 不 可 能 的 。 同 样 ， 时 间 压 力 与 一 个 缓 慢 的 分 析 流 程 相 结 合 ， 将 会 引 导
20、蛋 白 质 纯 化 朝 向 更 少 的 监 测 和 最 优 化 的 组 合 方 向 发 展 。 所 有 涉 及 到 靶 蛋 白 特 性 和 污 染 物 的 信 息 在 纯 化 方 法 研 究 过 程 中 都 将 会 有 帮 助 作 用 ， 使 选 择 更 快 、 更 容 易 的 纯 化 技 术 和 优 化 纯 化 条 件 成 为 可 能 ， 同 时 可 以 避 免 那 些 可 能 使 靶 蛋 白 失 活 的 因 素 。 随 着 蛋 白 纯 化 方 法 和 评 价 纯 化 效 果 （ 产 量 、 生 物 活 性 ， 回 收 率 ） 的 进 展 ， 研 制 快 速 和 可 以 信 赖 的 分 析
21、方 法 已 经 成为必需。 明确目标 目标 : 为纯度和产量设定最少的目标，维持生物学活性和节约钱和时间。 按照对产品的最终使用来规定产品纯度要求 下面所示的是对纯度要求的例子。 纯度非常高 99% 用于治疗，体内试验 纯度高 95- 99 % X(射)线衍射晶体分析法 和多数物理、化学特性鉴定方法 纯度适中 95 % 用于抗原来制备抗体、N端测序分析12 13 明确“关键”污染物 尽可能快的鉴定可能残存的污染物的特性 有 研 究 指 出 某 种 蛋 白 的 纯 度 大 于95% （ 即 靶 蛋 白 占 总 蛋 白 的95% ） 是 远 远 不 能 保 证 这 个 纯 度 能 够 满 足 某
22、种 预 期 的 应 用 。 对 于 那 些 通 常 的 注 释 ， 例 如“ 蛋 白 经 过 考 马 斯 亮 蓝 染 色SDS-PAGE 后 ， 证 明 是 同 质 的” 同 样 是 正 确 的 。 如 果 残 留 物 由5% 的 无 害 的 杂 质 组 成 ， 那 么95% 的 纯 度 或 许 是 可 以 接 受 的 。 然 而 ， 即 使 是 很 少 量 的 可 能 存 在 生 物 学 活 性 的 杂 质 也 可 能 在 研 究 和 治 疗 应 用 方 面 产 生 显 著 的 问 题 。 所 以 区 分 那 些 必 须 被 完 全 去 除 的 污 染 物 和 那 些 减 少 到 一 定 水
23、 平 就 可 以 接 受 的 污 染 物 是 非 常 重 要 的 。 既 然 不 同 的 起 始 物 质 类 型 会 含 有 不 同 的 污 染 物 种 类 ， 它 们 会 产 生 不 同 的 污 染 问 题 。 在所需要的纯度之上要优于在所需要的纯度之下。 尽 管 纯 化 步 骤 数 应 该 最 少 化 ， 但 是 最 终 产 物 的 质 量 不 能 打 折 扣 。 如 果 纯 化 产 物 的 纯 度 低 并 且 污 染物是未知的，随后的一系列研究结果的可信性将会受到怀疑。 那 些 能 够 使 蛋 白 降 解 或 者 失 活 或 者 干 扰 分 析 结 果 的 污 染 物 应 该 尽 可 能
24、 早 的 去 除 。 在 整 个 纯 化 进 展 过 程 中 ， 在 纯 化 的 每 一 个 阶 段 都 必 须 考 虑 维 持 蛋 白 活 性 的 需 要 。 如 果 在 纯 化 的 第一步蛋白酶就被除去，将靶蛋白转移到一个友好温和的环境中是特别有益的。 下 游 的 生 产 过 程 是 在 限 定 的 经 济 框 架 里 完 成 的 ， 用 安 全 的 和 可 以 信 赖 的 方 法 完 成 靶 蛋 白 的 纯 化 ， 达 到 需 要 的 纯 度 和 回 收 率 。 经 济 是 一 个 非 常 复 杂 的 问 题 。 在 商 业 化 生 产 中 ， 时 间 对 于 市 场 来 说 是 非 常
25、 重 要 的 ， 它 能 够 弱 化 一 些 问 题 ， 对 纯 化 方 法 进 行 有 效 的 组 合 ， 使 回 收 率 、 容 量 或 者 速 度 三 者 达 到 最 佳 的 组 合 。 产 品 的 稳 定 性 和 可 靠 性 同 样 受 到 很 大 的 关 注，因为一个批次产品的失败会产生很多严重的后果。 生 物 制 药 方 面 的 纯 化 或 许 涉 及 到 一 些 特 殊 的 安 全 问 题 ， 例 如 检 测 和 去 除 病 原 体 、 热 原 、 免 疫 原 等 污 染 物 和 致 癌 的 危 害 物 质 。 用 分 析 技 术 锁 定 特 殊 的 污 染 物 质 为 了 证
26、明 它 们 已 经 被降低到可以接受的水平是必须的。12 13 定义靶蛋白的特性和关键的杂质 目标 : 为靶蛋白确定一个“稳定性窗口”为了更容易的选择纯化技术和优化组合，并且避免在纯 化过程中蛋白质失活。 检 查 蛋 白 稳 定 性 窗 口 至 少 包 含 溶 液 的pH 值 和 离 子 强 度 。 所 有 涉 及 到 靶 蛋 白 和 污 染 物 特 性 的 信 息 都 将 有 助 于 指 导 选 择 蛋 白 纯 化 的 分 离 技 术 和 试 验 条 件 。 对 于 靶 蛋 白 或 者 相 关 蛋 白 的 基 础 数 据 ， 包 括 蛋 白 的 大 小 、 等 电 点 (pI) 和 疏 水
27、性 或 者 可 溶 性 数 据 。 非 变 性 一 维 和 二 维 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 能 够 表 明 样 品 的 复 杂 性 和 靶 蛋 白 及 主 要 污 染 物 的 特 性 。 特 别 重 要 的 是 对 蛋 白 质 稳 定 性 窗 口 的 了 解 ， 可 以 避 免 使 蛋 白 质 发 生 不 可 逆 失 活 的 条 件 。 检 查 靶 蛋 白 质 对 溶 液pH 值 和 离 子 强 度 的 稳 定 性 窗 口 是 明 智 的 。 表1 显 示 的 是 不 同 蛋 白 质 的 特 性 是 如何能够影响一个纯化策略的。 表 1. 蛋白质特性和它们对选择纯化策略的影响 样品
28、和靶蛋白质特性 对选择纯化策略的影响 对温度的稳定性 需要在更低的温度下快速操作 pH 稳定性 提取或者纯化缓冲液的选择。离子交换条件的选择，亲 和或者反相色谱的选择。 对有机溶剂的稳定性 选择用反相色谱条件 去污剂需要量 考虑色谱步骤的影响和去除去污剂的需要。考虑去污剂 的选择。 盐 （离子强度） 针对沉淀技术、离子交换技术和疏水性相互作用色谱， 选择需要的条件。 辅助因子对于蛋白稳定性或者 添加剂、pH值、盐和缓冲液的选择 对活性蛋白酶的敏感性 需要快速去除蛋白酶或者加入蛋白酶抑制剂 对于金属离子的敏感性 需要在缓冲液中加入EDTA 或者 EGTA 对氧化还原剂的敏感性 需要加入还原剂 分
29、子量 选择凝胶过滤介质 蛋白质电荷 选择离子交换条件 生物专一性的亲和力 选择配基作为亲和介质 翻译后修饰 选择簇特异性亲和介质 疏水性相互作用 针对疏水色谱选择介质 14 15 建立分析测定法 目 标 ： 随 着 纯 化 技 术 的 进 展 ， 评 价 纯 化 效 果 （ 产 量 ， 生 物 活 性 ， 回 收 率 ） 和 帮 助 优 化 纯 化 方 法 。 选择快速和可以信赖的分析方法 为 了 在 纯 化 方 法 的 研 究 中 取 得 有 效 的 进 展 ， 应 该 评 价 每 一 步 纯 化 的 效 果 。 实 验 室 应 该 使 用 下 列 分析方法 ： 针对靶蛋白的快速和可以信赖的
30、分析方法。 确定纯度。 确定总蛋白量。 针对那些必须被去除的杂质的分析。 针 对 靶 蛋 白 的 可 以 信 赖 的 分 析 方 法 的 重 要 性 无 论 怎 么 强 调 都 不 过 分 。 检 测 色 谱 收 集 馏 分 应 该 能 够 确 保 所 使 用 的 分 离 缓 冲 液 不 会 干 扰 分 析 结 果 。 靶 蛋 白 质 的 纯 度 经 常 用SDS-PAGE 、 毛 细 管 电 泳 法 、 反 相 色 谱 法 或 者 质 谱 法 进 行 评 价 。Lowry 或 者Bradford 分 析 方 法 经 常 用 于 总 蛋 白 质 含 量 的 测 定 。Bradford 分 析
31、方 法 非 常 适 用 于 那 些 脂 类 含 量 高 的 样 品 的 分 析 ， 而 脂 类 杂 质 可 能 会 干 扰Lowry 分 析 方 法 的 结 果 。 对 于 大 规 模 蛋 白 的 纯 化 ， 针 对 靶 蛋 白 质 和 关 键 杂 质 进 行 分 析 经 常 是 基 本 的 要 求 。 在 实 践 中 ， 当 为 了 某 种 研 究 目 的 而 纯 化 某 种 蛋 白 质 ， 鉴 定 和 建 立 那 些 有 害 污 染 物 的 特 殊 的 分 析 方 法 太 消 耗 时 间 以 至 于 不 去 鉴 定 和 建 立 那 些 有 害 污 染 物 的 分 析 方 法 。 一 个 实
32、 用 的 方 法 是 将 蛋 白 纯 化 到 某 种 水 平 ， 然 后 在 存 放 一 段 时 间 后 用SDS-PAGE 分 析 蛋 白 质 ， 检 查 蛋 白 酶 的 切 割 作 用 。 对 实 验 进 行 适 当 的 质 控 ， 包 括 对 蛋 白 质 生 物 活 性 的 分 析 ， 将 会 指 示 杂 质 是 否 会 干 扰 研 究 结 果。 样品提取和澄清 样品处理最小化 添加剂的使用最小化 尽早去除对目标蛋白有损伤作用的污染物 定义 ：从原材料中将靶蛋白进行初级分离 目 标 ： 为 了 进 一 步 的 纯 化 ， 准 备 澄 清 样 品 。 去 除 微 小 的 颗 粒 物 质 或
33、 者 其 它 与 色 谱 分 析 不 相 溶 的 污染物。14 15 样 品 制 备 是 否 优 先 于 第 一 个 色 谱 纯 化 步 骤 取 决 于 样 品 的 类 型 。 在 一 些 情 况 下 可 以 将 样 品 直 接 用 于 第 一 步 步 骤 ， 即 样 品 捕 获 。 例 如 ， 细 胞 培 养 上 清 可 以 直 接 用 适 宜 的 色 谱 基 质 例 如Sepharose Fast Flow 进 行 纯 化 ， 可 能 仅 仅 需 要 一 个 小 的pH 值 的 调 整 或 者 离 子 强 度 调 整 。 然 而 ， 对 于 一 些 样 品 ， 提 取 和 澄 清 步 骤
34、是 最 基 本 的 。 如 果 样 品 需 要 进 行 提 取 ， 那 么 所 选 择 的 技 术 必 须 是 稳 定 的 和 适 用 于 将 来 可 能 用 到 的 所 有 规 模 的 纯 化 。 我 们 必 须 注 意 到 ， 某 种 技 术 例 如 硫 酸 铵 沉 淀 法 ， 经 常 用 于 小 规 模 的 纯 化 ， 可 能 不 适 用 于 非 常 大 规 模 的 样 品 制 备 。 如 果 一 个 纯 化 方 法 将 要 用 于 扩 大 规 模 生 产 ， 缓 冲 液 和 添 加 剂 的 选 择 必 须 要 仔 细 考 虑 。 在 这 些 例 子 中 ， 便 宜 的 缓 冲 液 ，
35、例 如 在 实 验 室 常 用 的 醋 酸 缓 冲 液 或 者 柠 檬 酸 缓 冲 液 ， 较 适 用 于 更 复 杂 的 组 分 。 同 样 我 们 也 应 该 注 意 到 透 析 和其它用来调整样品状态的通用方法不适用于非常大量的或者非常小量的样品准备。 对 于 重 复 性 纯 化 ， 使 用 一 种 稳 定 的 和 能 够 处 理 样 品 差 异 的 提 取 和 澄 清 技 术 。 这 样 可 以 确 保在下一次的纯化步骤中得到同一个重复性的产物，不管是否与开始物质具有差异性。 只 有 在 必 要 的 时 候 才 使 用 添 加 剂 来 保 证 样 品 的 稳 定 性 或 者 提 高 样
36、 品 的 提 取 效 果 。 选 择 那 些容易被去除的添加剂。添加剂可能需要通过额外的步骤去除。 使 用 Sephadex G-25 凝 胶 过 滤 介 质 预 装 柱 ， 应 用 于 实 验 室 规 模 的 快 速 的 样 品 净 化 ， 如 表2所示： 表 2. 针对样品净化的预装柱 预装柱 每次运行的样品体积 每次运行回收的 代码样品体积 HiPrep 脱盐26/10 2.5 -15 ml 7.5 - 20 ml 17-5087-01 HiTrap 脱盐 0.25 - 1.5 ml 1.0 - 2.0 ml 17-1408-01 Fast 脱盐 PC 3.2/10 0.05 - 0.2
37、 ml 0.2 - 0.3 ml 17-0774-01 PD-10 脱盐 1.5 - 2.5 ml 2.5 - 3.5 ml 17-0851-01 Sephadex G-25 凝 胶 过 滤 介 质 ， 在 实 验 室 和 规 模 化 生 产 中 ， 被 用 于 制 备 和 净 化 蛋 白 质 大 于5000 的样品。样品体积高达30%，或者在一些情况下可以上样量达到40%的总柱体积。在单一的步骤 中 ， 样 品 被 脱 盐 ， 转 换 到 一 个 新 的 缓 冲 液 中 ， 低 分 子 量 的 物 质 被 去 除 。 具 有 较 高 的 体 积 容 量 ， 并 且 对 样 品 浓 度 相 对
38、 不 敏 感 ， 这 一 步 的 速 度 可 以 满 足 大 体 积 的 样 品 被 快 速 和 高 效 的 处 理 。 使 用 高 样 品 体 积 装 载 ， 可 以 产 生 使 样 品 分 离 并 且 对 样 品 的 稀 释 最 小 化 （ 大 约1 ：1.4 ） 的 结 果 。 在 第8 章包含更进一步的对样品储存、提取和净化步骤的详细说明。16 17 Sephadex G-25 也 被 用 于 改 变 样 品 的 条 件 。 例 如 ， 在 两 步 纯 化 之 间 快 速 调 节pH, 缓 冲 液 交 换 和 脱 盐 。 需要考虑的介质 Sephadex G 25凝胶过滤 应用于高分子
39、量和低分子量的快速组分分离。 典 型 的 流 动 速 度 是60 cm/h (Sephadex G-25 Super ne, Sephadex G-25 Fine), 150 cm/h (Sephadex G-25 Medium). 在单一步骤中样品的净化和捕获的组合 如 果 需 要 处 理 大 量 体 积 的 样 品 或 者 将 来 这 个 方 法 需 要 扩 大 纯 化 规 模 ， 考 虑 使 用STREAMLINE 扩 张 床 吸 附 技 术 。 这 项 技 术 适 用 于 大 规 模 的 重 组 蛋 白 的 纯 化 和 单 克 隆 抗 体 的 纯 化 。 含 有 颗 粒 的 原 始 样
40、 品 不 需 要 过 滤 和 离 心 就 能 够 应 用 于 扩 张 床 。STREAMLINE 吸 附 是 针 对 使 用STREAMLINE 柱 而 经 过 特 殊 设 计 的 。 在 液 态 化 床 的 工 业 应 用 上 ， 它 们 可 以 达 到 在 高 流 速 下 的 高 产 率 。 这 个 技 术 不 需 要 对 样 品 进 行 纯 化 ， 因 此 将 样 品 的 准 备 和 捕 获 结 合 于 单 一 步 骤 中 。 粗 制 样 品 被 应 用 到 STREAMLINE 介 质 的 扩 张 床 中 。 在 靶 蛋 白 被 捕 获 的 同 时 细 胞 碎 片 、 细 胞 、 颗
41、粒 物 质 、 全 部 细 胞 和 污染物被除去。流动是可以反相的，靶蛋白在洗脱缓冲液中被解吸附。 需要考虑的介质：STREAMLINE (离子交换, 亲和, 疏水性相互作用) 直接从粗制品中完成样品的净化和捕获 按 照 类 型 和 应 用 进 行 设 计 的STREAMLINE 吸 附 剂 可 以 直 接 用 于 处 理 从 发 酵 匀 浆 和 细 胞 培 养/ 发 酵 的粗制的原料，以200 - 500 cm/h 的流速进样。 注释 ：cm/h：流速 (线流率) =流量率/柱的横断面积。16 17 第三章 三步纯化策略 原 理 随 着 样 品 的 背 景 信 息 、 分 析 方 法 和 样
42、 品 的 制 备 和 提 取 步 骤 的 进 展 ， 可 以 应 用 三 步 纯 化 策 略 对 样 品 进 行 纯 化 。( 图3). 这 个 策 略 被 用 来 帮 助 发 展 制 药 工 业 中 治 疗 性 蛋 白 的 纯 化 过 程 ， 同 时 在 帮 助 研 究性实验室研制纯化方案时也是同样有效。 Step Purity 图. 3. 样品制备和三步纯化策略 在纯化过程中分配一个特定目标物到每一步中。 在 三 步 纯 化 策 略 中 ， 一 个 特 定 目 标 物 被 分 配 到 每 一 步 中 。 纯 化 问 题 与 特 定 的 步 骤 相 关 联 ， 在 很 大 程 度 上 取 决
43、 于 起 始 物 质 的 特 性 。 因 此 ， 一 个 纯 化 步 骤 的 目 标 物 将 依 据 它 在 纯 化 过 程 的 位 置 而 不 同 ， 即 在 开 始 阶 段 ， 将 产 物 从 粗 制 样 品 中 分 离 时 ， 在 中 间 纯 化 阶 段 ， 为 了 进 一 步 纯 化 已 经 部 分 纯 化 的 样 品 时 ， 或 者 在 最 后 阶 段 将 纯 化 好 的 样 品 进 行 净 化 处 理 。 三 步 纯 化 策 略 保 证 更 快 的 纯 化 方 法 进 展 和 用 更 短 的 时 间 和 更 经 济 的 方 式 纯 化 产 品 。 在 捕 获 阶 段 ， 将 目 标
44、 物 进 行 分 离 、 浓 缩 并 且 对 目 标 物 进 行 稳 定 化 处 理 。 目 标 物 被 浓 缩 和 转 移 到 另 外 一 个 环 境 中 ， 可 以 保 存 它 的 活 性 或 效 价 。 最 终 ， 其 它 关 键 污 染 物 被 大 量 的 去 除 。 在 中 度 纯 化 阶 段 ， 制 品 中 的 大 量 杂 质 已 被 去 除 ， 例 如 其 它 的 一 些 蛋 白 质 和 核 酸 、 内 毒 素 和 病 毒 。 在 样 品 精 细 纯 化 阶 段 ， 由 于 大 量 的 杂 质 已 经 被 去 除 ， 仅 剩 下 一 些 痕 量 的 杂 质 或 者 是 与 目 标
45、 物 非 常 接 近 的 相 关 物 质 。 制 品 完 成 了 最 终 的 纯 化 。 应 该 注 意 的 是 三 步 纯 化 策 略 并 不 意 味 着 所 有 的 纯 化 策 略 都 必 须 经 过 三 个 纯 化 步 骤 。 例 如 ， 对 靶 蛋 白 的 捕 获 和 中 度 纯 化 可 能 在 一 个 纯 化 步 骤 中 就 完 成 了 ， 或 许 中 度 纯 化 和 最 后 的 精 致 可 能 在 一 个 纯 化 步 骤 中 就 完 成 了 。 类 似 的 ， 如 果 对 纯 度 的 要 求 很 低 时 ， 一 个 快 速 的 捕 获 步 骤 就 足 够 获 得18 19 想 要
46、得 到 的 结 果 ， 或 者 制 品 开 始 的 纯 度 就 很 高 ， 只 要 经 过 精 细 纯 化 阶 段 就 可 以 达 到 需 要 的 纯 度 的 产 品 。 对 于 治 疗 性 蛋 白 的 纯 化 ， 或 许 需 要 四 阶 段 纯 化 或 者 五 阶 段 纯 化 步 骤 才 能 够 完 全 达 到 对 纯 度 和 安 全 性 的 最 高 要 求 。 对 于 一 个 有 效 的 纯 化 过 程 ， 捕 获 、 中 度 纯 化 和 精 细 纯 化 阶 段 的 优 化 组合是非常关键的。 纯化技术的选择和组合 每 一 种 技 术 都 在 分 辨 率 、 容 量 、 速 度 和回收率之
47、间达到一种平衡 样品处理最小化 纯化步骤最少化 在每一步骤中使用不同的技术 目标 : 对于一个设定纯度的产品通过快速途径进行纯化 对 于 色 谱 分 离 技 术 而 言 ， 考 虑 到 回 收 率 、 分 辨 率 、 速 度 和 容 量 等 因 素 ， 每 种 不 同 的 色 谱 技 术 将 会 得 到 不 同 的 绩 效 表 现 。 一 种 色 谱 技 术 可 能 对 于 上 述 参 数 的 其 中 之 一 是 最 优 的 ， 例 如 分 辨 率 或 者 在 两 种 参 数 间 获 得 最 佳 的 平 衡 ， 例 如 速 度 和 容 量 。 对 于 按 照 这 些 参 数 其 中 之 一 进
48、 行 优 化 的 分 离 纯 化 方 法 所 产 生 的 结 果 ， 与 那 些 使 用 同 样 的 技 术 但 是 聚 焦 于 一 个 可 选 择 参 数 所 产 生 的 结 果 有 显 著 不 同 。 如 同 第49 页 所 显 示 的 结 果 那 样 ， 离 子 交 换 技 术 既 可 以 用 于 捕 获 阶 段 也 可 以 用 于 样 品 的精细纯化阶段。 选择一种技术满足纯化步骤所要求达到的目标 捕 获, 用 简 单 的 模 式 表 示 ， 参 考 在 纯 化 过 程 中 加 载 靶 蛋 白 的 总 量 。 在 一 些 情 况 下 ， 加 载 样 品 的 总 量 或 许 会 受 到
49、上 样 体 积 的 限 制 （ 如 在 凝 胶 过 滤 色 谱 中 ） 或 者 受 到 大 量 存 在 于 样 品 中 的 污 染 物 的 限 制，而不是靶蛋白的总量的限制。18 19 速 度 ， 在 开 始 纯 化 阶 段 速 度 是 一 个 最 重 要 的 环 节 ， 需 要 尽 可 能 快 的 将 样 品 中 的 污 染 物 如 蛋 白 酶 等必须去除的物质除去。 回 收 率 在 整 个 纯 化 的 进 程 中 ， 回 收 率 的 重 要 性 会 逐 渐 增 加 ， 因 为 被 纯 化 产 品 的 价 值 在 逐 渐 增 加。回收率受到对样品破坏过程的影响和不适宜色谱柱条件的影响。 分 辨 率 高 分 辨 率
