1、 BioWiseTech Co., LTD 1AdvCell 免疫细胞无酚红无血清培养基AdvCell 免疫细胞无酚红无血清培养基（BICBM0002）的核心是采用无血清替代物为细胞提供一个营养全面和平衡的环境。产品适用于人及哺乳类动物免疫细胞的培养,包括 T、DCCIK、NK 等细胞的研究及应用。一方面，鉴于培养基无酚红特性，在细胞培养过程中若需检测光吸收， 可排除酚红的干扰；另一方面，在培养细胞之后获得的上清液可直接用作美容护肤品添加物。通过添加不同的细胞刺激因子，可高效快速扩增相应的免疫细胞。 产品号 Cat No : BICSFM0002 产品组成名称 产品号 规格 储藏条件 运输Ad
2、vCell 免疫细胞无酚红基本培养基AdvCell Immune Cell Phenol Red-free Base MediumBICBM0002 500 ml 2-8避光 冰袋/常温AdvCell 免疫细胞添加物 AAdvCell Immune Cell Culture Supplement ABICS0001A 20 ml -20避光 干冰AdvCell 免疫细胞添加物 BAdvCell Immune Cell Culture Supplement BBICS0001B 1 ml -20避光 干冰 产品适用范围适用于人及哺乳类来源的免疫细胞包括 T、DC、CIK、NK 细胞的培养。 培养
3、条件37，5 CO2 无菌恒温培养。 操作步骤以下过程作为常规免疫细胞无酚红培养的一般准则，如需在生物反应器或培养袋中高密度培养，应优 BioWiseTech Co., LTD 2化条件来确定最佳的操作步骤，BICSFM0002中各组分（BICBM0002、BICS0001A、BICS0001B）在使用前37解冻之后混合。【T 细胞培养】1.准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC） ，或根据标准的外周血单个核细胞解冻程序，在37的水浴，快速解冻（1 分钟）冻存的外周血单个核细胞。2.用生理盐水洗涤细胞，根据需要也可加入2-5热灭活的人自体血浆。3.用电子（即 Coulter 计数器，VI-细胞）
4、或手动的方法（即血球计数仪）给细胞计数。4.离心细胞，清除洗涤缓冲液。5.加入用AdvCell 免疫细胞无酚红基本培养基（ BICBM0002）培养，培养初期，用含细胞因子（如 IL-2）的培养基重悬PBMC，CD3 + T 细胞密度保持在大约0.5-110 6/ml，转移细胞到相应的细胞培养容器（培养袋、培养瓶） 。随后可应用各种操作激活 T 细胞，包括添加刺激的抗体或抗原呈递细胞。无论培养T 细胞的规模大小，细胞均可被隔离，激活和扩大。6.在37，5CO 2 的潮湿培养箱中培养细胞，给予并维持细胞在对数期生长所需要的营养。为了保持细胞在对数期的增长，当细胞密度超过110 6/ml 时，需要
5、分离传代，维持细胞密度在0.5-110 6/ml（例如，2106个细胞/ml 以上，按1：4 比例0.510 6 细胞/ml） 。在静态平板培养中为了获得最佳的气体交换，建议培养基深度不超过1 到1.2 cm。【单核细胞树突状细胞DC培养】1.准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC） 。2.将外周血单个核细胞铺在培养瓶中，加入适量 AdvCell 免疫细胞无酚红基本培养基（ BICBM0002）。3.在 37，5% CO 2 的恒温培养箱中孵育 2-3 小时。4.弃掉含非贴壁细胞的培养基。5.用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14 +单核细胞）三次。BioWiseTech Co., LTD 36
6、.添加重组人IL-4 和重组人GM-CSF 到 AdvCell 免疫细胞无酚红基本培养基（ BICBM0002） ，至终浓度分别为50100 ng/ml 和50 ng/ml，并以此培养基培养贴壁细胞。保持细胞度在1310 5 细胞/cm 2 之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。7.在37，5% CO 2 的潮湿培养箱中连续孵育5天，建议培养3天左右已添加了IL-4 和GM-CSF 的 AdvCell 免疫细胞无酚红基本培养基（BICBM0002）换液，换液过程保留贴壁和不贴壁的所有细胞。8.培养6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a、CD80、CD86、HLA
7、-DR） 。9.向 AdvCell 免疫细胞无酚红基本培养基（BICBM0002）中添加 1 ng/ml 的 LPS 或者 50 ng/ml 的 TNF- 诱导的树突状细胞的成熟。【CIK 细胞培养】1.将采集的外周血收集到 2支离心管中，2000 rpm/min 离心 5 min，弃上清，将沉淀细胞混合，到加生理盐水至 25 mL，使沉淀细胞充分悬浮。另取 1支离心管，加入淋巴细胞分离液 20 mL，用滴管将血细胞悬液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。 2.2000 rpm/min离心 20 min 后，从管底到液面分为 4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层
8、、外周血单个核细胞层（PBMC 层）、血浆层。用吸管将 PBMC层吸出，转移至另一支离心管中。 3.加生理盐水至 40 mL，1500 rpm/min 离心 5 min，结束后弃上清，将沉淀细胞悬浮，加入生理盐水至 40 mL充分混匀后，1500 rpm/min 离心 5 min。如此共离心洗涤 3次。 最后一次离心结束后，弃上清，将沉淀细胞均分为 3份，分别转移到 3个培养瓶中，各加入 40 mL的免疫细胞无酚红基本培养基（BICBM0002）培养，分别记为 A1、A2、A3。 5.2h后取出培养的细胞，分别将 A1、A2 和 A3中悬浮的淋巴细胞转移至另 3个培养瓶中，分别记为B1、B2、
9、B3。3 个 B瓶中加入 IFN-，第二天加入 IC因子（含有 IL-2和抗 CD3单抗），诱导培养 CIK；3 个含有贴壁细胞的 A瓶中各加入 40 mL 的免疫细胞无酚红无血清培养液和 H1、Hb 因子，诱导培养 DC。6.DC培养过程中，如有发黄，则换液，补加 H1和 Hb因子。 7.CIK培养过程中，如发现培养液发黄，则换液，换液后补加 IL-2。如发现有细胞团块结为不良絮状，则BioWiseTech Co., LTD 4用离心管收集后静置沉降 5 min左右，待絮状物沉淀后，小心将上清细胞悬液倒回培养瓶中。 8.DC于第 7天加入肿瘤抗原和 TNF，第 8天铲下收集后与相应的 CIK
10、混合共培养。DC 瓶弃去。如果总的细胞量过于庞大，也可将 DC和 CIK混合后均分到 A和 B瓶中。 9.共培养的 DC-CIK于第 10天做微生物检测。 10.细胞悬浮液的制备：培养结束后，将培养瓶中的细胞悬液用离心管收集，1500 rpm/min，5 min 离心洗涤 3次，将 25 ml白蛋白加入 250 ml盐水中，终浓度 1%，加入细胞沉淀，配成细胞悬液。 【NK 细胞培养】1.抽取患者外周血 50 ml，将采集的血样转入 50 ml 离心管，2000 rpm 离心 10 min。2.离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血清于新的 50 ml 离心管，盖好离心管盖于 40水浴锅中孵育
11、30 min。 3.孵育结束后，再 1400 rpm(340 g)离心 10 min,吸取上清于新的离心管保存 4备用。 4.用移液管将下层的血细胞与生理盐水 1:1 混匀，按 1：1 将悬液缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管（注意：不要打乱液面分界保持液面分层明显）。 5.将离心机的升速与降速调至最低，400 g 离心 30 min；离心结束后，用 5 ml 移液管吸取中间白膜层于新的 50 ml 离心管，并用生理盐水洗涤离心两次，以去除多余血细胞。 6.根据计数结果调整细胞浓度，充分混匀后按 1- 210 6/ml 密度接种于含免疫细胞无酚红基本培养基 （BICBM0002）的培养瓶中，并
12、添加相关 NK细胞活化及增殖的相关因子，这些相关因子包括 anti-CD3、 IL-2、IL-4、IL-5、IL-12、IL-15、retronectin。 其中，anti-CD3、IL-2、IL-4、IL-12 为必选因子，浓度根据具体情况调整。7.当细胞生长到第三天离心换液 （340 g 离心 10 min）更换新鲜培养基及相关细胞因子。8.以后 4-6 天每天镜检观察，根据细胞悬液颜色添加培养液，每次添加应为总体积的三分之一左右。 9.第七天计数，当细胞量大于 610 7 时，则需加入扩增试剂，如细胞数量在 3-6 10 7 时，则长至第八天在添加 NK 扩增培养试剂，加液时使总细胞浓度保持在 1-1.5 10 6cell/ml。 BioWiseTech Co., LTD 510.当培养液体积大于 150 ml 或细胞数量大于 1.5 10 8 时则需转移至培养袋培养（气泡尽量排空，以免影响细胞生长）。 11.第 8-11 天每天镜检观察计数，根据细胞悬液颜色加培养液。第 12-14 天观察需加液 时，细胞浓度需保持在 2 10 6cell/ml。 12.当细胞达到所需剂量时，即可离心收集细胞待用。
