1、第五章 PCR技术原理 Principal of polymerase chain reaction,1,PCR，聚合酶链式反应，是二十世纪80年代发展起来的新技术。广泛应用于分子生物学molecular biology和基因工程gene engineering及其它与DNA鉴定相关的领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。,2,PCR 技术是通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。 PCR过程在自然界是不存在的，它是人们对DNA复制的深刻理解而带来的产物 现代PCR概念是Kary B. Mullis于20世纪80年代早期
2、发明的。通过与Cetus公司的同事合作，最终导致现在广泛使用的PCR技术的诞生,3,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,PCR技术的创建,4,PCR 的出现与其它好的想法的出现一样，是许多现成技术累积的结果，是科学技术发展的必然产物。比如寡核
3、苷酸的合成技术，通过DNA聚合酶用寡核苷酸指导DNA的合成 Mullis 的创新点在于使用两个与DNA 的两条不同链互补的寡核苷酸作为引物特异性的扩增两条引物之间的DNA区域，并且重复进行。与此同时，得到的扩增产物又可作为下一轮扩增的模板，从而使得扩增产物呈几何级数递增 特别重要的是，从嗜热细菌中分离的耐热DNA聚合酶的发现使PCR从概念成为真正适用的技术,5,第一节 PCR 的基本原理,6,体内DNA的复制,7,1基本要素和扩增原理 基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。 模板template：待拷贝的 DNA 称为模板，dsDNA or ssDNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。 引物
4、primer： DNA 复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导 DNA 的合成。在 PCR 扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。 底物substrates：dNTP DNA 聚合酶：Taq DNA polymerase， DNA 复制的动力，在 dNTP 等底物存在时在引物的引导下沿着模板 DNA 合成互补的 DNA 链。,8,基本原理： DNA合成的基本原理 扩增原理：无细胞分子克隆法。在微量离心管中,加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶，一对合成的DNA引物，通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品
5、是经过30次循环，最终使基因放大了数百万倍，扩增了特异区段的DNA带。,9,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。,10,2PCR 扩增的步骤 变性（denaturation） ：将模板 DNA 置于 92 -96，进行变性处理，使 dsDNA 在高温下解链成为 ssDNA ，以便与引物结合，为下轮反应做准备，且热变性不改变其化学性质 退火（annealing）：将温度降至 37 -72，使引物与模板的互补区相结合 延
6、伸（extension）：在 72 条件下，DNA模板-引物复合物在Taq DNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对与半保留复制原理，将 dNTP 连续加到引物的 3-OH 端，合成 一条新的与模板DNA链互补的半保留复制新链 重复循环变性-退火-延伸三个热反应过程可获得更多的“半保留复制新链”，而且这种新链又可成为下次反应的模板。经过 20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段，能将待扩目的基因放大几百万倍。,11,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,12,13,第二节 PCR 反应体系,Buffer 缓冲液dN
7、TP 原料Primer 引物DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,14,1缓冲液 标准的缓冲液10mM TrisHCl ， pH 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ）下，pH 值接近 7.2 。 1.5mM MgCl2（ 0.5-2.5mM） ，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，有时使用 Mn2+ 。Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。 50mM KCl 有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。,15,2脱氧核苷三磷酸（dNTP） 脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dN
8、TP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 0.2mM（即饱和浓度）。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。,四种dNTP浓度应相等，提高忠实性 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,16,3引物 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1uM ，即 1pmol/ul ， 在 100 l 反应体系中相当于61013个分子。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 g 的产物，足以用于常规分析。,浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降
9、,17,引物设计原理： 长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp ，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5 。 小于 20 个碱基的引物： Tm=4（G+C）+2（A+T） 14-70 个核苷酸的引物： Tm=81.5+16.6（1gK+）+0.41（G+C）%-（675/N） N 表示引物的核苷酸数目， K+ 表示单价离子即钾离子的浓度。,18, 避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。 G+C 含量：尽量控制在 40% - 60% 之间， 4 种碱
10、基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3末端的重复排列。 引物的 3 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。,19,4模板的数量和质量 模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增，104至107个模板分子可达到满意的效果。 1ug人类或哺乳动物单拷贝基因组 DNA 3105 拷贝 10ng酵母菌DNA 3105 1ngE.coli DNA 3105 1ng1kb DNA 9106 1% M13 噬菌体噬菌斑 106,单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,20
11、,5DNA 聚合酶 1-2U 早期使用Klenow DNA聚合酶 Taq DNA 聚合酶 来源：嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermus aquaticus）分子生物学特性：94kDa ，单分子酶，在 75 活性最强 活性 ： 5-3 合成活性和 5-3 外切活性 , 无 3-5 外切活性。 半衰期：95 的半衰期为 40 min；92.5，2hr；97.5 ，5min 。 启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，在 72 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。由于没有 3-5 外切活性，在扩增过程中有 8.9-1110-5 的错配几率。,21, Tth DNA 聚合酶 来源：嗜热热细菌（Th
12、ermus thermophilus）HB8 ，由 Promega 公司开发成商品。 94kDa ，74 进行扩增， 95 的半衰期为 20min 在 Mg2+存在下，以 DNA 为模板合成 DNA 在 MnCl2 存在下，可以 RNA 为模板合成 cDNA 可在高温下做 RT-PCR 、反转录和引物延伸（primer extension）反应， 避免 RNA 反转录过程中形成的二级结构。,22,具有 3-5 外切活性的高温 DNA 聚合酶 a.Vent DNA 聚合酶 来源：由火山口分离的嗜热球菌 Thermococcus litoralis 中分离的第一个具有 3-5 外切活性的高温 DN
13、A 聚合酶，由 New England Blabs 公司开发出商品。 85kDa ，具有更长的半衰期，在 100（使用 MgSO4）时，其半衰期为 1.8 小时。Taq，5min,23,b. Pwo DNA 聚合酶来自 Pyrococcus woesei（BM），大小为 90kDa ，由原德国宝灵曼公司开发。 在 100 half time 2 hr，出错率低。 是使用较多的具有 3-5 外切活性的且具有高保真度的 PCR 酶。,24,c. Pfu DNA 聚合酶 来自激烈热球菌（Pyrococcus fariosus），具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性，是目前使用最广泛的具有 3-5
14、 外切活性的 PCR 酶。,具有3-5外切酶（校对）活性，Pfu DNA聚合酶是现今所描述过的所有热稳定酶中精确度最高的一种。 Pfu DNA聚合酶的出错率大约是110-6/每碱基对，而Taq DNA聚合酶的出错率大约是110-5/每碱基对。 将Pfu DNA聚合酶使用在那些需要高精确度的PCR应用中，包括克隆、基因表达和突变分析。,25,d.商用混合酶 为了提高扩增的保真度或扩增较长的 DNA 片段，将 Taq DNA 聚合酶的强启动能力和具有 3-5 外切活性的高温 DNA 聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。,26,第三节 PCR反应程序,1常规程序 94-96 预
15、加热几十秒至几分钟，使模板 DNA 充分变性，然后进入扩增循环。 变性 94 30s 退火 55 30s 延伸 72 1min 72 3-7min 4 保存。,27,2复性（退火）和延伸温度通常在 50-60 之间具体的温度主要由引物的 Tm 值决定延伸温度绝大多数设定为 72 若高Tm 可将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR 。 随机引物，37 ,28,3反应时间 变性： 30 s，若模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。 复性： 30 s(20-40s) 延伸时间：由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。,29,4
16、循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为 104105 数量级时，循环数通常为 2535 次。 3105 25-301.5104 30-351103 35-4050 40-45,30,平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因：底物和引物的浓度已经降低dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用扩增产物自身复性高浓度扩增产物变性不彻底。,31,5PCR 反应液的配制 PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方
17、法与其它酶学反应一样，在最后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。,32,问题1：对于具 3-5 外切活性的高温 DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物。 解决方法：将反应成分分开配制 A 管：模板、引物和 dNTP ，以及调整体积的 H2O B 管：缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来,33,34,35,36,37,第四节 PCR 产物的克隆,1添加限制性酶切位点 为了使 PCR 产物能够方便的装载到克隆载体上，可在扩增的过程中在其两端添加限制性酶切位点。 在设计引物时，除了考虑正常的特异性序列外，在引物的 5 末
18、端添加酶切位点的序列以及保护序列。 在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的 DNA 片段内部不存在。 如果对扩增的 DNA 片段的序列不清楚，可优先选用切割频率相对较少甚至酶切位点为 8 个碱基序列的酶切位点。,38,2A/T 克隆法 Taq DNA 聚合酶：末端转移酶的活性，可在 DNA 片段的 3 末端添加一个核苷酸，通常为 A 。因此，Taq DNA 聚合酶扩增的产物可与 T-载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的。 载体：T-载体。 pGEM-T 和pGEM-T Easy（Promega），pMD18-T和 pMD19-T （TaKaRa）。 这些载体特点是，将普通的克
19、隆载体切成线状，并使之在 3 末端含有一个凸出碱基 T 。 pGEM-T是在pGEM-5Zf（+）基础上改造而来的，即在其多克隆位点中的 EcoR 处将载体切成平末端的线状 DNA ，再在其 3 末端添加一个 T 碱基,39,pMD18-T Vector、pMD19-T Vector 这两种载体分别由pUC18、pUC19 载体改建而成，在pUC18、pUC19载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T“ 而成。,40,41,42,在 DNA 的 3 末端添加一个 T 碱基的方法： 用末端转移酶和底物 d
20、dTMP 可以产生单个 T 的突出末端 有些识别不对称序列的限制性内切酶，如 Mbo 、Xcm 和 Hph，在切割 DNA 后可直接产生一个 3 突出的 T Hph G G T G A N N N N N N N N/ C C A C T N N N N N N N/N 用 Taq DNA 聚合酶和高浓度的 dTTP 也可产生 3 突出的 T,43,3平端克隆 用于克隆具有3-5外切活性的聚合酶扩增的PCR产物,1) pPCR-Script Amp SK（+）克隆载体,从 pBluescript SK（+）噬菌粒改造而来 MCS： Xba和 Spe 位点 Srf 位点（5-GCCC / GGG
21、C-3）。,44,克隆 DNA 片段时，先将载体用 Srf切成线状，再与目标 DNA 片段混合作连接反应。 在连接体系中除了添加 T4 DNA 连接酶外，还加入 Srf 酶。在这个反应体系中，当载体发生自连后， Srf 酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中。 只有当载体与目标 DNA 片段连接后，酶学反应才能稳定下来，从而将总体的反应平衡向载体与目标 DNA 片段连接这个方向倾斜。 连接效率很高，在转化大肠杆菌后通过-互补筛选出现80%以上的白色菌落，其中90%以上是阳性重组子,45,46,2）pCR-Blunt 克隆载体 另一种用于提高克隆平末端片段效率的载体 最大特点是在 la
22、cZ 基因的下游融合了一个 ccdB 基因，该基因对大肠杆菌是致死的。 该载体大小为 3.5kb ，含卡那霉素抗性基因和 Zeocin 抗性基因。 在克隆外源平末端 DNA 片段时，先将该载体切成线状，再与目标 DNA 连接，转化大肠杆菌。如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源 DNA 片段与载体连接后， ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。 获得阳性重组子的效率在80%以上,47,48,49,PCR的类型,1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般
23、是50-100:1用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究,50,在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例. 还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA,51,高浓度引物,低浓度引物,52,2)反向 PCR（inverse PCR）,当获
24、得一段 DNA 后，若要得到与其相邻的未知 DNA 片段，可通过反向 PCR 来实现。标准的 PCR 反应需要两个方向相对的引物。反向 PCR 主要是解决侧翼未知序列没有引物可用的问题。 首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板 DNA ，再将酶切后的 DNA 片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的 DNA 片段扩增出来。,53,反向,正向,54,55,3）多重PCR（复合PCR，multiplex PCR）,在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR 其结果是产生多个PCR产物 其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同
25、.,56,多重PCR的用途主要有两方面:,多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染,可系统组合的有:肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠,病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯
26、疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.,通过比较扩增产物的大小和预期设计的大小，可判断样品中含有哪些基因 可用于检测特定基因序列的存在和缺失,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,57,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,57,4）利用接头的PCR,将基因组DNA用限制性内切酶切割，将序列已知的接头连接到酶切片段两端，以提供PCR需要的另一端引物 根据已知序列设计的引物和根据
27、接头序列设计的引物可将已知序列侧翼的未知序列扩增出来,58,NH2,5,3,SP1 SP2,LP2 LP1,SP1和 LP1,PCR,SP2和 LP2,巢式PCR,利用3末端修饰的接头扩增未知DNA片段,59,5) 原位PCR,原位聚合酶链式反应（In Situ PCR,IS-PCR）是由Hasse等于1990年首创。就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增
28、产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,59,原位PCR的作用 鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,60,操作步骤 固定组织或细胞:将组织
29、细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶. 蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K. PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置 .杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交. 显微镜观察结果.,61,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,61,原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病
30、的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏感性高于一般的PCR.,逆转录酶,DNA聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,6）RTPCR 反转录PCR,62,用途: 用于测定基因表达的强度 鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性 克隆mRNA的5和3末端序列 从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库,第五节 PCR 鉴定和诊断,1普通诊断 通过 PCR 技术可以方便快捷地鉴定生物样品中是否含有特定的 DNA 序列，从而广泛用于物种或品系的鉴定，以及临床样本的诊断，病原物的污染鉴别和法医鉴定等。最简单的莫过于设计一对引物或几对引物，加以对照，通过 P
31、CR 扩增来检测样品中的特定 DNA 的存在。,63,2等位基因鉴定 在一个反应体系中使用一对以上引物的 PCR 就成为多重 PCR ，其结果产生多个 PCR 产物。通过比较扩增产物的大小和预期设计的大小，可以判断样品中含有哪些基因。多重 PCR 可用于等位基因的鉴定。若在一个品种中多个相似基因共存，可设计一系列引物对其进行鉴定。,64,苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的PCR鉴定,1， 利用crylA基因特异性的混合引物对该菌株扩增出大小对应于crylAa、crylAb和crylAc基因的产物 3，该菌株中克隆到的cry218基因经鉴定属于crylAc基因,65,3随机扩增多态性 DNA（ra
32、ndom amplified polymorphic DNA , RAPD） 在常规 PCR 扩增中所用的引物一般是序列特异性的，是针对某个基因或 DNA 序列而设计的。其长度一般在 20 个核苷酸左右。随着引物的长度缩短，在基因组 DNA 上出现与之互补配对序列的几率进一步增加，用于 PCR 扩增后产物的数量也随之增加。当引物的长度缩短到一定程度后，单一引物就可以扩增出多个 DNA 产物。根据这一现象，美国杜邦公司的 Willianms 等人于 1990 年设计出一种建立随机扩增多态性 DNA ，即 RAPD 的方法。,66,用任意引物进行基因组指纹分析是检测DNA多态性的一种通用方法，对遗
33、传学图谱绘制、系统发育学和种群生物学都很有用。 随机引物在一定条件下可产生DNA指纹，反应条件只要求引物能起始DNA合成，而不管此时引物和模板的配对是否完全。 有些引物起始的DNA合成发生在两条相对的DNA链上，其中最有效的那些反应在扩增过程中互相竞争而产生指纹，有的只有几个主要的PCR产物，有的则包括100多个,67,以成对混合方式使用10碱基引物 引物需经过筛选,4扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism, AFLP) 是针对基因组 DNA 的限制性酶切片段进行选择性 PCR 扩增从而建立 DNA 指纹的技术。 selective
34、restriction fragment polymorphic（SRFA）扩增指纹分析。由 Vos 于 1995 年所提出， 其作用原理为：首先将基因组 DNA 以两种限制性内切酶完全切割，之后再将合成的并与这两个限制酶产生的末端相对应的接头 (adapters) 与酶切 DNA 片段的两端连接。然后以含有接头序列和酶切位点序列的引物，对连接产物作 PCR 扩增。最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 PCR 产物分离，从而产生 DNA 指纹。,68,AFLP 是针对基因组限制性酶切片段进行 PCR 扩增的技术，因此亦属于以 PCR 反应为基础的分子标记。与 RAPD 相比，结果的重复性进一步提高，
35、蕴藏的信息以及指纹的精度也进一步加大。,69,引物由3部分组成:5端核心部分为对应接头的序列 紧接3端为酶切位点的序列 3末端位3个选择性核苷酸序列引物名称 核心 酶切位点 延伸 EcoR5-GACTGCGTACC AATTC NNN-3,5、实时荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。荧光定量 PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。,70,常规PCR技术：对 PCR 扩增反
36、应的终产物 进行定量和定性分析。但实际上通过这种末端测量产物方式进行定量分析会带来很大的误差。因为。在扩增过程中不可能每一轮反应的扩增效率都是 100% ，在任何一个循环中扩增效率的细微差异都可能导致最终扩增产物累积的差异。 定量PCR技术：对 PCR 扩增反应中每一个循环的产物进行定量和定性分析,71,通过特定设计的 PCR 仪器来实时检测 PCR 扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好地推算模板的起始浓度。这种工作方式就称为实时 PCR ，同时由于在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，所以亦称实时荧光 PCR 或实
37、时荧光定量 PCR 。,72,荧光定量PCR标记方法：内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular BeaconsDual Probes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor (Intergen),73,SYBR Green I结合到双链DNA的小沟中，与双链DNA结合后才发荧光，不掺入链中的SYBR染料分子不发射任何荧光信号,74,变性：无荧光信号,75,Taqman探针是一种寡核苷酸探针，其序列对应于待扩增的目的DNA内部的序列。 5端连接一个荧光基团（reporter，R），3端连接一个荧光淬灭剂（quencher，Q），当完整的探针处于游离
38、或与目的序列配对时，荧光基团与淬灭剂接近，发射的荧光被淬灭剂吸收，荧光强度很低。 但在进行PCR 延伸反应 时，探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活Taq 酶的5外切酶活性，将探针5端连接的R荧光分子从探针上切割下来，使荧光基团与淬灭剂分离，荧光基团便可激发出荧光。每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例，因此，根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量,荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET),76,
39、Q,R,模板，引物和探针,模板和探针杂交，无荧光信号,退火,延伸,聚合反应,探针,探针,延伸,Taq酶切下5端荧光素出现荧光,正向引物,反向引物,荧光 定量 PCR 的 TaqMan 探针 工作 原理 示意图,77,发夹型杂交探针,Molecular beacons也是加入了荧光基团和淬灭基团的探针。 结构上是环状的寡核苷酸探针，由茎部和环部组成，其中茎由互补配对的序列组成，环与目的序列完全配对。在无靶序列时，探针始终是环状，荧光基团被淬灭基团淬灭，检测不到荧光信号。当探针与靶序列结合后，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。,78,79,80,81,定量起始模板
40、的浓度 基因型分析 鉴定产物 单核苷酸多态性（SNP）检测 对目的序列有很高的特异性 荧光背景低 但是探针设计困难，无终点分析功能，只能用于一个特定的目标，价格较高,82,荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶,83,全新4通道实时荧光定量PCR仪,84,本章小结,PCR 技术是通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。 其过程与 DNA 复制一样有三个步骤：模板变性，引物与模板复性，延伸。,PCR 扩增，主要的是引物设计，引物设计需要遵循一定的原则。,85,用于 PCR 的 DNA 聚合酶种类很多，性质各异，可以满足不同的实验需要。PCR 技术应用广泛，可以通过 A/T 克隆、 平末端克隆等方法介导克隆 反向 PCR ，反转录 PCR 在基因操作中也扮演了重要角色。 PCR 技术还广泛应用于鉴定、诊断等领域。,86,
