1、创先职称论文发表网创智医学论文网 肾上腺疾病胰蛋白酶处理法 摘要：肾上腺是一对重要的具有内分泌功能的实质性器官，在机体内主要作用是分泌糖皮质激素和盐皮质激素。肾上腺正是因其具有特殊的内分泌功能，而在有关研究中日益被人们所重视。我们知道，通过离体培养的动物细胞具有培养条件可以人为进行控制而且便于观察和检测的特点，因而细胞培养技术广泛应用于生物学领域的基础研究中。动物细胞培养可用来研究动物的正常细胞的形态特征、生长发育、细胞营养、代谢、自身生理等微观过程。国内外许多学者通过对肾上腺细胞进行体外培养来揭示肾上腺细胞的分泌功能。关 键 词：肾上腺；疾病治疗；胰蛋白酶处理法肾上腺疾病是泌尿外科的常见病，
2、包括肾上腺皮质和髓质疾病，如皮质醇症 (cushings 综合征)、醛固酮症、嗜铬细胞瘤、肾上腺髓质细胞增生症等。近年来，国内外学者对本病的诊断与治疗越来越重视，有关临床和基础方面的研究，尤其是在治疗领域的研究，正在不断地深入。细胞因其具有丰富的来源、可长期保存及弱免疫原性等特点，细胞移植逐渐成为一种新的治疗方法来替代某些器官移植。而人们普遍认为在细胞移植前将组织或细胞在适当条件下进行培养，可减轻移植后的排斥反应，有益于提高细胞移植疗效，因此细胞培养技术逐渐被应用于临床治疗。有文献报道，体外培养肾上腺细胞并将其移植己成为治疗肾上腺皮质激素分泌功能不全等疾病的重要方法7。为了更好地解决肾上腺细胞
3、移植的问题，人们进行了很多体外细胞实验以及在体动物实验，力图寻找到一种更加成熟、重复性更强的肾上腺细胞体外培养技术。目前，肾上腺细胞的体外原代和传代培养技术均还不是很成熟，众多学者都在积极地进行摸索和改良细胞培养技术(比如改良培养基、消化酶以及消化时间、血清浓度或种类等方面)，从而为肾上腺细胞的移植治疗肾上腺疾病提供良好的实验和实践基础。我们的实验是在体外进行大鼠肾上腺皮质细胞的原代培养，继而观察其在不同时间点的生长特征及分泌功能的动态变化，形成了一套成熟的肾上腺细胞培养技术，为后期行同种大鼠肾上腺皮质细胞移植的研究打下了良好基础。同时，本实验也为进一步在肾上腺疾病的现有临床治疗基础上发展一类
4、新的治疗学机制提供了理论基础。 细胞培养技术的发展与完善主要是围绕防止细胞的污染、改进细胞培养的方法、设计新型的培养容器或载体、研发不同的培养基等多个方面进行的。传统的贴壁依赖型细胞的培养是通过静止或转瓶等培养方式来获得的，操作比较繁锁，而且耗费了空间和人力。1967 年， VanWezel.首次提出了“微载体”培养系统 l8，使贴壁依赖型细胞贴附在微载体上悬浮于液体培养基中生长，它兼备了平板培养和悬浮培养的优势，增加了培养面积同时又获得了均一的培养环境条件(温度、PH 值、C 浓度、葡萄糖浓度等)，便于控制及放大以获得高密度的培养细胞和优化下游控制。有学者为了避免细胞遭到受体免疫系统的直接攻
5、击，延长其在机体内的生存时限，在培养细胞时将其制成微囊化细胞，这极大地丰富了原代细胞培养的稳定性，更为细胞移植提供了方便网。等应用可生物降解的聚 p 一轻基丁酸醋与肾上腺细胞共培养，发现它对肾上腺细胞的生长、增殖、分泌功能无影响，反而有助于细胞的生长，这为肾上腺细胞的培养提供了一种新的方法，也为细胞移植提供了一个良好的载体。另外，目前普遍应用的肾上腺细胞的培养方法是使用消化能力较强的胶原酶消化处理，将细胞分离出来以后予以体外培养，但其结果并不满意，主要原因可能与细胞分离困难及培养要求较高有一定关系。酶消化法就是采用胶原酶、胰蛋白酶创先职称论文发表网创智医学论文网 进行消化、分解细胞的周围成分，
6、将细胞释放出来，以达到分离、培养的目的，此法分离细胞比较快捷，细胞的产出率也比较高。本实验采用了浓度为 0.25%的胰蛋白酶消化法。胰蛋白酶是应用最为广泛的消化酶，作用强烈，多用于软组织原代细胞培养和细胞传代。它主要可水解细胞间蛋白质，疏松组织，离散细胞，减轻对细胞的损伤，又去除了大部分成纤维细胞，但低浓度 (0.125%)的胰蛋白酶不适于消化组织。由于成纤维细胞贴壁生长较其他细胞更快，其对生长条件的要求也不高，在一般条件下，它会快速的生长，消耗掉培养基中的大部分营养成分，从而会抑制其他细胞的生长。因此，我们在进行细胞原代培养之前，首先要设法去除成纤维细胞，以消除其对培养细胞的干扰。去除成纤维
7、细胞并不困难，有很多种方法可以借鉴，比如酶消化法、机械化去除法、反复贴壁法、流式细胞仪分离法等。我们在实验中所用的方法为反复贴壁法，成纤维细胞贴壁过程较快，大约 10 一 30 分钟即可完成贴壁，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即会浮起。我们利用成纤维细胞和上皮细胞的这一特性即可将成纤维细胞去除。 我们知道，选择不同的培养基来建立细胞的最适培养条件逐渐成为国内外学者研究的热点。培养基既是细胞培养中供给细胞营养和促进增殖的基础物质，也是细胞生长繁殖的直接环境，可分为天然培养基和合成培养基。其中，血清是体外细胞培养中使用最多、最广的天然培养基，绝大部分动物细胞的体外培养都要
8、使用血清。血清是一种组分相当复杂而尚不完全明确的混合物，至少含有 1000 多种不同的蛋白质，总蛋白量高达 6。150g/LI。血清在动物细胞培养中起着多方面的作用:提供细胞生存和增殖所必需的生长调节因子。 补充基础培养基中没有或量不足的营养成分，以及主要的低分子营养物。是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。在一些情况下，中和毒性物质保护细胞不受伤害。 给培养液提供良好的酸碱缓冲系统。提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的伤害。有相关报道肾上腺细胞在体外用含胎牛血清的培养基进行培养显示细胞生长良好，我们的实验采用含 20%胎牛血
9、清的培养基，亦证实了这一点。选用牛血清培养细胞的原因主要有:来源充足、制备技术成熟、经过了长时间的应用考验、人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞的培养都是适合的，而且传统的培养基中血清浓度都是 5 一 30%，最常用的是 10%。本实验用 20%的胎牛血清培养基进行体外培养，结果表明肾上腺细胞 4 天后生长旺盛，数量增多，细胞成活率达95.940rk，2 周后细胞出现皱缩和破碎，开始衰老。不同时间点肾上腺细胞生长特征及形态学的变化，对于肾上腺细胞移植最佳时间的选择也有一定的参考价值。另外，相关文献显示:有关血清浓度对其他多种细胞，如许旺细胞，成纤维细胞，破骨细胞等培养中的影响，国内外学者研究较多，然而一直以来肾上腺细胞培养技术中培养基血清浓度都遵循传统方法，国内外尚没有相关比较研究。为了节省培养液的成本;减少血清中含有的不确定蛋白质或者其它组分带来干扰和差异的风险，提高制品的安全性;减少制品纯化的损失，便于分离纯化;降低细胞污染率等，无血清或低血清浓度培养基逐渐成为人们研究热点。我们将在今后的研究中进一步寻找一种促肾上腺细胞生长的特定生长因子; 通过比较观察在不同血清浓度培养基的条件下培养的肾上腺细胞的生长特征、细胞增殖情况及其分泌功能，同时与含生长因子的无血清培养基组进行对照研究，寻找到一种肾上腺细胞培养的最适低血清培养基。创先职称论文发表网创智医学论文网
