1、单核细胞的分离在外周血中，要分离到足够数量的单核细胞，通常不用比重为 1.077 的细胞分层液，因为单核细胞的比重与淋巴细胞近似，且含量仅为 3%-8%，故很难将两者分开。而如用黏附法，则黏附细胞的剥离较难控制，剥离过度易造成细胞损伤，剥离不全使细胞回收率下降。以下介绍的两种方法可获得量多且纯度和活力都较好的单核细胞。（一）Colotta 方法【实验原理】见 Percoll 非连续密度梯度分离法。【主要试剂与器材】（1） 人外周血分离的 PBMC 悬液。（2） HBSS(无 Ca2+ 、Mg 2+)，含 10% FCS 和 25mmol/L HEPES 的 RPMI-1640 (pH7.2)。
2、（3） 46%浓度的 Percoll。【操作步骤】（1） 将分离获得的 PBMC 用 HBSS 洗涤 2 次（1000rpm，5min） ，加 5ml 完全培养液重悬。（2） 将细胞悬液缓慢叠加在 5ml 的 46% Percoll 上，室温离心（2200rpm，20min 或 400g，25min） ；得到 3 个带：第一带为富集的单核细胞（83%） ；第二带含少量的单核细胞；第三带则为淋巴细胞。（3） 收集第一、第二带的细胞，经洗涤后，重悬于培养液中。【注意事项】将细胞悬液叠加在 Percoll 分离液上时，应缓缓加入，保证二者间的比重界间不被破坏，否则影响分离效果。（二）密度梯度离心法【
3、主要试剂与器材】（1） 肝素抗凝血。（2） 不同比重的聚蔗糖-泛影葡胺细胞分层液：A 液：90g/L 聚蔗糖 15ml，加 500g/L 泛影葡胺 10ml (比重为 1.14)。B 液： 90g/L 聚蔗糖 17.5ml，加 500g/L 泛影葡胺 10ml (比重为 1.13)。C 液： 90g/L 聚蔗糖 20ml，加 500g/L 泛影葡胺 10ml (比重为 1.12)。D 液：90g/L 聚蔗糖 24ml，加 500g/L 泛影葡胺 10ml (比重为 1.08)。【操作步骤】（1） 在 15ml 离心管内依次加入 A 液、B 液、C 液和 D 液各 2ml，制成梯度。（2） 在 D 液上叠加肝素抗凝血（用 HBSS 稀释）约 2ml，室温下，离心（1000 rpm，40min） ；血浆与 D 液的交界面即为单核细胞层（纯度可达97%） 。（3） 用吸管小心吸取该细胞层，经洗涤后，重悬于培养液中备用。【注意事项】同“ 外周血 PBMC 的分离”。-摘自免疫学技术 ，科学出版社，葛海良，张冬青 主编
