1、、回收 PCR 产物：在进行 PCR 扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如 BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的 BUFFER，以及各酶在公用 BUFFER 里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切 3 个小时，其实 1 个小时已经足够。应用大体系，如 100 微升。纯化问题：纯化 PCR 产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引
2、物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR 产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是 TAKARA 的纯化柱试剂盒酶量的问题：以 TAKARA 的为例，其对 1 单位酶的定义如下：在 50 l 反应液中，30温度下反应 1 小时，将 1 g 的 DNA 完全分解的酶量定义为 1 个活性单位(U)。 而该酶浓度约为 15 单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解 15g 的 DNA，而一般从 1-4ml 菌液提出的 DNA 约为 3g，而 PCR 纯化后的产物（50 体系）约为 3g，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。2、酶切、回收后的 P
3、CR 产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的 PCR 产物片段=1：10 ，一般取前者 0.03pmol，后者取 0.3pmol。pmol 为单位的 DNA 转换为为 g 单位的 DNA：（X pmoles长度 bp650）/ 1,000,000 （注：长度 bp650 是该双链 DNA 的分子量）所得数值即为 g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66g,如载体是 5380bp，则 0.03pmol 为0.035.380.66=0.106524g。测 DNA 浓度可以在专用机子上测，注意 O
4、D 值，一般约 1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用 MARKER 进行估测，如MARKER2000，5 微升的 MARKER 每个条带约 50ng。连接反应：TAKARA 的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在 20 l 的连接反应体系中，6 g 的 DNA-Hind III的分解物在 16下反应 30 分钟时，有 90%以上的 DNa 段被连接所需要的酶量定义为 1 个活性单位（U） 。而它的浓度为 350 U/l ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间 3 个小时足已。3、转化：a、全量（10 l）加入至 100 l JM109 感受态细胞
5、中，冰中放置 30 分钟。 b、42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 c、加入 890 l AMP 阴性培养基，37振荡培养 60 分钟。 取 100l 铺板。也可离心后余 100l几个非常重要的问题1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为 LIGASE 酶很容易降解.为保险起见 ,一般连接 3 小时,16 度.2 对含有 AMP-RESISTENCE 的质粒铺板时,注意加 AMP 时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60 度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干3 对照的设
6、立：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种 BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设 4 个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都正常的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP 阴性板上用同一批感受态细胞铺板 20 微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。经 PCR 鉴定，克隆 90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选 4 个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。 。 。 。 。 。
