1、基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y2101395 ）；浙江省舟山市卫生局资助项目（2010G02 ）作者单位：316004 舟山，浙江省舟山医院中科院免疫基因组学联合实验室（曾芳、刘晓光）；316004 舟山，浙江省舟山医院心胸外科（乐涵波）通讯作者：乐涵波， E-mail： ；Tel：0580-2558088高/低侵袭转移性肺癌干细胞模型的建立曾芳 刘晓光 乐涵波摘 要 目的 以人肺癌NCI-H446细胞为研究对象，建立一种高/低侵袭性肺癌干细胞（High/Low Invasion Lung Tumor Stem Cells, H/L-ILTSCs）模型，并鉴定其生物学特性。方法 首先
2、，利用transwell小室迁移实验分离高/低迁移性NCI-H446细胞。取高 /低迁移性NCI-H446细胞采用transwell小室侵袭实验分离高/低侵袭转移性NCI-H446细胞。然后，以CD133 、CD44为肺癌干细胞（Lung Tumor Stem Cells, LTSCs）表面标志，采用磁珠分选法分离NCI-H446 细胞 H/L-ILTSCs并进行纯度鉴定。最后，采用MTT法、transwell侵袭及免疫缺陷动物成瘤等实验，检测H-ILTSCs 、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞的生长增殖，体外侵袭转移及体内成瘤能力。结果 H-ILTSCs生长增殖，体外侵袭转移及体内
3、成瘤能力均高于 L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞，而L-ILTSCs与正常NCI-H446无显著差别 。结论 正常人肺癌细胞NCI-H446中可以分离和富集H/L-ILTSCs，且二者存在着干性差别。 （肺癌细胞，何来正常与异常之说？）关键词 肺癌 NCI-H446细胞 侵袭转移性 肺癌干细胞 CD133 CD44 Establishing High/Low Invasion Lung Tumor Stem Cells model. Zeng Fang, Liu Xiaoguang, Le Hanbo. Zhoushan Hospital, Zhejiang 316004, Chin
4、aAbstract Objective The study subject of the research is human lung cancer cell line NCI-H446, establishing high/low invasion lung tumor stem cells (H/L-ILTSCs) model and to identify their biological properties. Methods First, transwell immigration assay was used to separate high/low immigration NCI
5、-H446 cells. Then the high/low invasion NCI-H446 cells were isolated from high/low immigration NCI-H446 cells by transwell invasion assay. Second, we used CD133 and CD44 as markers of human lung cancer stem cells (LTSCs), separated H/L-ILTSCs by magnetic activated cell sorting and purity identificat
6、ion. Third, the growth and proliferation, tumor invasion in vitro and tumorigenicity potential and metastasis in vivo were detected by MTT assay, transwell invasion assay, nude mouse transplanted tumor. Results the growth and proliferation, tumor invasion in vitro and tumorigenicity potential and me
7、tastasis in vivo of H-ILTSCs were higher than L-ILTSCs and normal NCI-H446 cells. But it had no difference between L-ILTSCs and normal NCI-H446 cells. Conclusions H/L-ILTSCs could be isolated and expanded from human lung cancer cell line NCI-H446, and the both cells had different biological properti
8、es.Key words Lung cancer；NCI-H446 cell line；Invasion；Lung Cancer stem cell；CD133；CD442近 20 年来，中国肺癌导致的死亡超过癌症总死因的 20，其发病率和死亡率在我国男性居恶性肿瘤之首位，在女性仅次于乳腺癌居第二位 1。虽然近年来肺癌的诊治水平有了明显进步，形成了以手术切除为主，化疗、放疗、各种介入治疗、免疫和中医药治疗为辅的综合治疗模式，但肺癌具有起病隐匿、潜伏期长、恶性高、进展快、侵袭性强、预后差、病死率高等特点，导致全球肺癌患者术后 5 年生存率仅 15% 2。其原因可能是肺癌干细胞(Lung Canc
9、er Stem Cells，LTSCs)的存在。LTSCs 成瘤能力极强，分化程度极低，是肺癌组织发生、发展、侵袭、转移、耐药、复发的基础和源头 3。有学者提出 LTSCs 既是肺癌转移的“种子” ，也是肿瘤侵袭和转移的主要承担者 4。因此，人们推断肺癌是肺癌干细胞增殖和分化形成的肿瘤器官，肺癌干细胞的残存是肺癌复发的根源 5,6。目前开展LTSCs研究的首要问题就是分离鉴定。普遍的方法是采用Hoechst 33342染色干细胞，经流式细胞仪分选肺癌细胞系侧群(Side Population，SP) 细胞的SP细胞分选技术，或者利用LTSCs特异性细胞表面分子标志CD133+/CD90+/Ep
10、CAM+等经磁珠或流式细胞仪分选LTSCs。然而这两种分选方法均存在自身局限性。SP法主要因为Hoechst染料的毒性，可能造成主群细胞自我更新能力及致瘤性低的假象。其次，分选后的SP细胞不能完全体现LTSCs的特性和活性，甚至不能在体外继续生长或体内成瘤。而采用细胞表面标志分离出来的LTSCs均一性不好，还可以细分成不同亚群，有些亚群的细胞根本不能成瘤，表明采用该方法筛选出来的不完全是LTSCs，或者是LTSCs存在着干性差别 7。基于此，课题组设想建立一种高/低侵袭性肺癌干细胞（High/Low Invasion Lung Tumor Stem Cells, H/L-ILTSCs）模型，可
11、以与目前的分选方法互为完善和补充，建立一种更加可靠的LTSCs。这对于LTSCs的机理研究及病理治疗均有重要的意义，为研究肺癌的侵袭和转移机制提供了新的思路。材料与方法1 材料 1.1 主要试剂 人小细胞肺癌细胞系NCI-H446购上海中科院典型培养物保藏中心。DMEM/F12（1：1）培养基购自Gibco公司。RPMI-1640培养基购自天津润泰科技发展有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自HyClone公司。Transwell小室购自coring公司。Matrigel胶购自BD公司。胰蛋白酶、MTT购自碧云天生物科技有限公司。NOD-SCID免疫缺陷裸鼠购自
12、上海中科院实验动物中心。CD133、CD44磁珠及流式抗体分别购自Miltenyi及BD公司。1.2 细胞培养 将NCI-H446 细胞用RPMI-1640培养液培养，内含 10%胎牛血清、青霉素100 U/ mL和链霉素100 mg/ L，置37 ，5%CO 2 环境下培养备用。2 方法 2.1 高/低迁移性的NCI-H446细胞的分离 取对数生长期NCI-H446细胞及未涂Matrigel胶的transwell小室，参照Tie文献操作 8。直接将NCI-H446细胞悬液加到上室，常规培养24 h后，分别取出侵袭小室上、下室细3胞。将穿过膜（下室）的细胞扩增培养后再次通过未涂Matrigel
13、胶的transwell小室，获取迁移能力高的下室细胞；将未穿过膜（上室）的细胞扩增培养后再次通过未涂Matrigel胶的transwell小室，获取迁移能力低的上室细胞。如此反复10次后，分离得到高/低迁移能力的NCI-H446细胞。2.2 高/低侵袭转移性的NCI-H446细胞的分离 取上述分离得到的对数生长期高/低迁移能力的NCI-H446细胞及涂有Matrigel胶的transwell小室。直接将高迁移能力的NCI-H446细胞悬液加到上室，常规培养24 h后，取出侵袭小室下室细胞，获得高侵袭转移能力的NCI-H446细胞；将低迁移能力的NCI-H446细胞悬液加到上室，常规培养24 h
14、后，取出侵袭小室上室细胞，获得低侵袭转移能力的NCI-H446细胞。2.3 H/L-ILTSCs、H/L-ILTSCs的分离 CD133、CD44为肺癌干细胞表面标志采用磁珠分选法。高侵袭转移性NCI-H446肺癌细胞筛选CD133 +/CD44+细胞为高侵袭转移能力NCI-H446肺癌干细胞；低侵袭转移能力NCI-H446肺癌细胞筛选CD133 +/CD44+细胞为低侵袭转移能力NCI-H446肺癌干细胞。参照Miltenyi公司试剂盒说明书，将高/低侵袭性NCI-H446肺癌细胞计数，加入CD133、CD44等磁珠混匀，冰上放置30min后，加CD133/2（293C3）-PE、CD44-
15、FITC染色孵育5min，进行磁珠分选后流式细胞仪上检测纯度。2.4 H/L-ILTSCs的鉴定及侵袭转移特性分析2.4.1 MTT比色法检测H-ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞的生长增殖能力 收集对数生长期细胞，每孔加入200ul，铺板使待测细胞调密度10 3-104/孔。5%CO 2，37孵育，过夜后在3，6，12，18，24，30，36，42，48h等不同时间点，每个时间点设5个复孔。每孔加20ulMTT溶液（5mg/ml） ，继续培养4h，小心弃去孔内培养液。加入150ul二甲基亚砜，低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各
16、孔的吸光值。酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度（A）值，以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线。2.4.2 Transwell肿瘤侵袭实验分析H-ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞的侵袭转移能力 取分离得到的高/低侵袭转移能力的NCI-H446细胞及正常NCI-H446细胞，在侵袭小室上室加对数生长期细胞110 4个/ml，用含0.5胎牛血清DMEM/F12培养基培养。下室加入含10%胎牛血清DMEM/F 12培养基。每组细胞重复3个样本，常规培养48 h后取出小室，擦去微孔膜上层细胞后结晶紫染色，显微镜下观察膜下层细胞并计数。采用结晶紫染色，计数5个视野下的平均穿膜数（
17、%） 。2.4.3 采用免疫缺陷动物成瘤能力对H-ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞进行鉴定 取对数生长期细胞及4-8周NOD-SCID免疫缺陷小鼠，按11比例与Matrigel混合。皮下注射100L。每周1次观察肿瘤生长状况，至肿瘤直径1 cm或者观察期达4周时将小鼠断颈处死，观察各组小鼠有无肿瘤形成，摘取皮下肿瘤检查瘤体生长形态、直径、质地、活动度。3 统计学处理 应用SPSS13.0软件处理数据，实验结果用均数标准差（ s）表示，实验重复至少3次。两组资料均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，P0.05）。故H-ILTSCs、L-ILTSCs细胞的磁珠
18、分选的纯度较高，达到了90%以上。见图1。H-ILTSCs Normal NCI-H446 cells L-ILTSCs图1 磁珠分选后H-ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞CDl33 +/CD44+细胞的比例。Fig.1 CD133+/CD44+ expression of H-ILTSCs、L-ILTSCs and normal NCI-H446 cells by magnetic activated cell sorting.2 采用MTT法检测H-ILTSCs、L-ILTSCs的生长增殖能力连续培养2d的吸光度值绘制生长曲线。MTT检测结果显示，随着时间的延长H-
19、ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞的吸光度值是逐渐增高的。在相同的时间内，H-ILTSCs的吸光度值较L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞明显增高，显示更强的体外增殖能力，差异具有统计学意义(P0.05）。因此，H-ILTSCs的细胞增殖能力很强，远高于L-ILTSCs和正常NCI-H446细胞。见图2。50.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.9001.0000 3 6 12 24 48hourAH-ILTSCsNormal NCI-H446 cellsL-ILTSCs图2 H-ILTSCs、L-ILTSCs及
20、正常NCI-H446细胞的生长增殖曲线。Fig.2 The growth curve of H-ILTSCs、L-ILTSCs and normal NCI-H446 cells.3 采用transwell肿瘤侵袭实验鉴定H-ILTSCs、L-ILTSCs细胞的侵袭转移能力取相同H-ILTSCs、L-ILTSCs细及正常NCI-H446细胞密度通过Transwell小室侵袭实验发现，H-ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞镜下5个视野细胞平均穿膜数分别是40240、423、594。H-ILTSCs的穿膜数是正常NCI-H446细胞的近7倍，是L-ILTSCs的近10倍，差异
21、具有统计学意义(P0.05）。因此，H-ILTSCs的细胞侵袭转移能力最强，远高于L-ILTSCs和正常NCI-H446细胞。见图3。H-ILTSCs Normal NCI-H446 cells L-ILTSCs图3 Transwell侵袭实验比较H-ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞的侵袭转移能力。Fig.3 Transwell invasion assay was used to compare the invasive ability of H-ILTSCs、L-ILTSCs and normal NCI-H446 cells.4 H-ILTSCs、L-ILTSCs
22、细胞免疫缺陷动物成瘤能力鉴定接种H-ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞裸鼠在6周后可观察到形成明显的移植瘤，成瘤率100%。同样以510 5细胞数量接种的情况下，H-ILTSCs形成的移植瘤体积为(2380.6685.86)mm，L-ILTSCs6形成的移植瘤体积为(2380.60685.86)mm，而正常NCI-H446细胞形成的移植瘤体积为(354.4067.62)mm。因此，H-ILTSCs细胞形成的移植瘤体积大于L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞的移植瘤体积(P0.05）。因此，H-ILTSCs相比L-ILTSCs细胞具有更强的干性特征，其裸鼠成瘤能力远高
23、于L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞。见图4。H-ILTSCs Normal NCI-H446 cells L-ILTSCs图4 H-ILTSCs、L-ILTSCs及正常NCI-H446细胞免疫缺陷动物成瘤能力比较（移植510 5细胞，6周）。Fig.4 Comparison of nude mouse transplanted tumor models of H-ILTSCs、L-ILTSCs and normal NCI-H446 cells (5105 cells，6 weeks).讨论LTSCs是肺癌研究领域的最新前沿，LTSCs的研究不但有助于了解肺癌的发生发展、复发转移，同
24、时可能对肺癌的临床诊断及治疗带来重大突破。它为肿瘤研究开辟了一个新的视野，这将彻底的颠覆肿瘤的既往治疗策略。然而,LTSCs从标志物筛选、细胞分选到培养技术，从基本生物学特性、启动肿瘤发生、侵袭转移机制到检测和治疗意义，都还存在诸多科学问题亟待解决。我们知道，肿瘤侵袭和转移启动中的一个关键过程是上皮细胞间质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，EMT以上皮细胞极性丧失并获得间质细胞表型和运动能力为特征，可调控肿瘤侵袭、转移，并可能诱导TSCs的形成。一些学者认为肿瘤转移不再是恶性肿瘤进展过程中的晚期事件，原位癌或未恶变的上皮细胞即有转移的能力
25、9。Peter 证实成熟的上皮细胞和转化了的癌细胞经过EMT能够获得干细胞特性 10。Hermann进一步判断EMT过程中关键细胞可能是TSCs，完成这种转移的癌细胞实际上是转移性TSCs或侵袭性TSCs 11。Mani也认为EMT可能使乳腺癌细胞同时具有转移和干细胞特性的通路，导致转移的肿瘤细胞在转移位置成长为肉眼可见的肿瘤 12。George等采用原代培养及永生化的前列腺癌细胞系，经流式细胞仪通过CD44 +等表面标志筛选前列腺癌细胞亚群，通过Matrigel肿瘤侵袭实验和NOD/SCID免疫小鼠体内成瘤能力证实CD44 +前列腺癌细胞具有侵袭性，基因芯片分析侵袭性前列腺癌细胞具有干细胞基
26、因组特征，属于前列腺TSCs 13。Hermann等利用人胰腺癌细胞作为模型，用原代和永生化细胞系识别出了一小群类似于干细胞的肿瘤细胞，其表达CD133和趋化因子受体4(Chemokinereceptor 4，CXCR4)，当研究人员将这些细胞注射入小鼠中时，小鼠形成肿瘤并很快发生转移，说明CD133 +和CXCR4 +癌干细胞是肿瘤转移所7必需的 14。陈宏昌发现CK7 -/CK20+/CEA+/SCCA-表达的UP-LN1癌细胞为TSCs，同时大量阳性表达CD133、ABCC1、ABCC4、ABCG2等常见TSCs标志，其表达CD133 +和CXCR4 +的TSCs具有侵袭和转移潜能，TS
27、Cs可被CXCR4诱导成为转移性TSCs 15。因此，本课题组基于 TSCs 前期研究成果，首次提出“H/L-ILTSCs”的概念，认为这可能是肺癌发生远处转移的基础及源头。以 H/L-ILTSCs 为重点研究对象，揭示肺癌侵袭、转移、复发的源头，在研究思路和研究内容上具有创新性。 那么，如何建立 H/L -ILTSCs 细胞模型呢？肿瘤侵袭和转移启动中的一个关键过程是上皮细胞-间质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，EMT 是以上皮细胞极性丧失并获得间质细胞表型和运动能力为特征，可调控肿瘤侵袭、转移，并诱导 TSCs 的形成。Milena
28、认为在肿瘤发展过程中，发生 EMT 改变的肿瘤细胞浸润、转移、成瘤能力均大为增强，并获得了干细胞特性 16。由上可知，分化成熟的上皮细胞和癌细胞能够通过 EMT 获得干细胞特性，反之，TSCs 能否发生 EMT 而获得强大的运动能力从而决定肿瘤的侵袭和转移，这种疑问成为我们课题思路及技术实施的关键点。课题组拟采用Transwell 肿瘤侵袭实验人工模拟 EMT 过程，从肺癌细胞 NCI-H446 中分离出高侵袭肝癌细胞是可行的。取分离得到的高侵袭肝癌细胞培养后，以 CD133+、CD44 +等公认度较高的 LTSCs 表面标志，经磁珠分选得到H/L-ILTSCs 也是可行的。 （讨论与本题无关
29、）据报道，CDl33、CD44 代表原始的、未分化的标志，可作为分选 LTSCs 的侯选标志 17。选择CDl33、CD44 细胞表面蛋白磁珠分选来识别和分离 LTSCs。通过流式分析纯度发现正常 NCI-H446 细胞中CDl33+/CD44+的细胞比例为(9.482.14)，远低于分选出来的 CDl33+/CD44+细胞比例为 90%以上的 H/L-ILTSCs。在 transwell 侵袭实验中，发现高度表达 CDl33+/CD44+的 H-ILTSCs 侵袭能力明显高于 L-ILTSCs 及正常肺癌细胞。（肺癌细胞原本没有“正常”之说，拟改为“原肺癌细胞”为宜。）本实验阐明 H-ILT
30、SCs 的生长增殖，侵袭转移及成瘤能力均高于 L-ILTSCs 及正常 NCI-H446 细胞。而 L-ILTSCs 的生长增殖，侵袭转移及成瘤能力与正常 NCI-H446 没有显著差别。提示正常 NCI-H446 细胞中可以分离和富集 H/L-ILTSCs。课题组建立了一种更为可靠的 H/L-ILTSCs 模型，且二者存在着干性差别。肿瘤的恶性程度与其细胞的生物学特性密切相关，恶性程度越高的肿瘤细胞体外生长增殖和迁徙转移能力越强；反之，恶性程度低的肿瘤细胞的体外生长增殖和迁徙转移能力越弱 18。因此，在未来的肿瘤防治研究或药物筛选中，应该强调针对 H-ILTSCs 的治疗作用，力求将 H -
31、ILTSCs 全部清除。此外，H/L-ILTSCs 的提出为下一步研究肺癌细胞转移的相关分子机制打下基础。参考文献1 中国疾病与癌症报告 2010。 http:/oncotherapy.us/pdf/cn.diseases.pdf2 Julian R, Ping Y, Stephen DC, et al. NonSmall Cell Lung Cancer: Epidemiology, Risk Factors, Treatment, and Survivorship J. Mayo Clin Proc, 2008, 83(5):58459483 Kim CF, Jackson EL, Woo
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