1、琼脂糖凝胶电泳进行 DNA/RNA 定量原理DNA（RNA）定量 分析可用紫外光谱分析，原理是 DNA（RNA）分子在 260 nm 处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与 DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的 DNA（RNA）带的亮度来分析，因为 EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上 EB 的量与 DNA 分子的长度 和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的 DNA（RNA）Marker 作为 DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品 DNA(RNA)的荧光强度就可以大致 表示 DN
2、A（RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准。琼脂糖凝胶的配制 根据所需凝胶的浓度秤取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量 EB 混匀，适当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔，如有气泡产生则用玻璃棒驱除，不能过早拔除梳子，应待凝胶完全凝结后才能拔除梳子。 3P1、P2、P3 的配制 P1 的配制：在 800ml 去离子水中溶入 Tris 碱6.06g，Na2EDTA?2H2O 3.72g，用 HCl 调整 pH 至 8.0，用去离子水调整容积至 1 升，每升 P1 内
3、加入 RNaseA100mg。 P2 的配制：在 950ml 去离子水中溶入 NaOH 8.0g，20SDS 50ml ，调整容积至 1 升。 P3 的配制：在 500ml 去离子水中溶入醋酸钾 294.5g，用冰醋酸调整 pH 值至 5.5，用去离子水调整容积至 1 升。 4常用缓冲液： TE pH 7.4 10mmol/LTris?Cl （pH7.4） 1mmol/L EDTA（pH8.0） pH 7.6 10mmol/LTris?Cl （pH7.6） 1mmol/L EDTA（pH8.0） pH 8.0 10mmol/LTris?Cl （pH8.0） 1mmol/L EDTA（pH8.0
4、） STE（亦称 TEN ） 0.1mmol/L NaCl 10mmol/LTris?Cl （pH8.0） 1mmol/L EDTA（pH8.0） STET 0.1mmol/L NaCl 10mmol/LTris?Cl （pH8.0） 1mmol/L EDTA（pH8.0） 5%Triton X-100 TNT 10mmol/LTris?Cl （pH8.0） 150mmol/L NaCl 0.05% Tween 20 电泳缓冲液 Tris-乙酸（TAE）：50 浓贮存液（每升）：242g Tris 碱 5 7.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0 ） 使用时再稀
5、释 50 倍。 Tris-磷酸（TPE ）：10 浓贮存液（每升）：108g Tris 碱 15.5ml 85磷酸（1.679g /ml） 40ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0 ） 使用时再稀释 10 倍。 Tris-硼酸（TBE）：5 浓贮存液（每升）：54g Tris 碱 27.5g 硼酸 20ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0 ） 使用时再稀释 10 倍。 碱性缓冲液：1使用液（每升）：5ml10mol/L NaOH 2ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0 ） Tris-甘氨酸：5浓贮存液（每升）：15.1g Tris 碱 94g 甘氨酸（电泳级） （
6、pH8.3 ） 50ml 10%SDS（电泳级） 2SDS 凝胶加样缓冲液 100mmol/L Tris?HCl（pH6.8） 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2溴酚蓝 20甘油 30丙烯酰胺： 将 29g 丙烯酰胺和 1gN,N亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的水中，加热至 37溶解之，补加 水至终体积为 100ml。用 Nalgene 滤器（0.45 孔径）过滤除菌查证该溶液的 pH 值应不大于7.0，置棕色瓶中 保存于室温。 10mol/L 乙酸铵： 把 770g 乙酸铵溶解于 800ml 水中，加水定容至 1L 后过滤除菌。 1mol/LCaC
7、l2： 在 200ml 纯水中（Milli-Q 水或相当级别的水）溶解 54gCaCl2?6H2O，用 0.22 滤器过滤除菌，分装成 10ml 小份贮存于20。 2.5mol/LCaCl2： 在 20ml 蒸馏水中溶解 13.5gCaCl2?6H2O，用 0.22 滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存于20 。 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT ）： 用 20ml0.01mol/L 乙酸钠溶液（pH5.2 ）溶解 3.09gDTT，过滤除菌后分装成 1ml 小份贮存于20。 0.5mol/LEDTA（pH8.0）： 在 800ml 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-N
8、a?H2O） ，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节溶液的 pH 值至 8.0，然后定容至 1 升，分装后高压灭菌备用。 溴化乙锭（10mg/ml）： 在 100ml 水中加入 1g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。 1mol/LMgCl2： 在 800ml 水中溶解 203.3gMgCl2?6H2O，用水定容至 1 升，分装成小份并高压灭菌备用。 酚：氯仿： 把酚和氯仿等体积混合后用 0.1mol/LTris?Cl（pH7.6 ）抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的 0.01mol/LTris?Cl（pH7
9、.6 ）液层，保存于 4。 磷酸缓冲盐溶液（PBS）： 在 800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4 和 0.24gKH2PO4，用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.4，加水定容至 1 升，高压蒸汽灭菌 20min。保存于室温。 乙酸钾溶液（用于碱裂解）： 在 60ml 5mol/L 乙酸钾溶液中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml;水，即成钾浓度为 3mol/L 而乙酸根浓度 5mol/L 的溶液。 3mol/L 乙酸钠（pH5.2 和 7.0）： 在 800ml 水中溶解 408.1g 三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH 值至 5.2 或用
10、稀乙酸调节 pH 至7.0，加水定容至 1 升，分装后高压灭菌。 1mol/LTris： 在 800ml 水中溶解 121.1gTris 碱，加入浓 HCl 调节 pH 至所需值。 pH HCl 7.4 70ml 7.6 60ml 8.0 42ml 应使溶液冷至室温后方可最后调定 pH 值，加水定容至 1 升，分装后高压灭菌。 Tris 缓冲盐溶液（TBS ）： 在 800ml 蒸馏水中溶解 8gNaCl、0.2gKCl 和 3gTris 碱，加入 0.015 酚红并用 HCl 调 pH 值至 7.4，用蒸馏水定容至 1 升，分装后在 15lbf/in2（1.34105Pa）高压下蒸汽灭菌 2
11、0 分鈡，于室温保存。 5mmol/LNH4Ac 溶液： 秤取乙酸铵 192.7g，加重蒸水 250ml 混匀，加重蒸水定容至 500ml，1.1kg/cm2 灭菌20min。 10mg/mlBSA（小牛血清白蛋白）溶液： 秤取 100mg 小牛血清白蛋白溶于 10ml 灭菌重蒸水中。置 4冰箱贮存备用。 10%十二烷基硫酸钠（SDS）： 在 900ml 水中溶解 100g 电泳级 SDS，加热至 68助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH 值至 7.2，加入水定容至 1L，分装备用琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制实际工作中常用的缓冲液配制见表琼脂糖凝胶电泳缓冲液配方a.TBE 浓储存液长时间存放后会
12、形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温条件下用玻璃瓶保存 5X 溶液，出现沉淀后则予以废弃。以往都以 lX 作为使用液( 即 1：5 稀释浓储存液)进行琼脂糖凝胶电泳。但 05X 的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以 1：10 稀释的储存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的 lXTBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的 2 倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用 1XTBE 以提供足够的缓冲容量b.碱性电泳缓冲液应现用现配在配制缓冲液时，不论哪一种都需要加适量的 EDTA，以除去 2 价金属离子。另外，硼酸与琼脂糖易形成复合物，
13、使凝胶带负电荷，可能会吸附带正电荷的物质。 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下：1. 制备 1%琼脂糖凝胶(大胶用 70ml,小胶用 50ml):称取 0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入 70 ml(50ml)1TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成 1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽 (制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到 65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.
14、室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液 ,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于 1X.用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳 ,电压 60-100V,样品由负极(黑色) 向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm
15、处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有 0.5 ug/ml 的溴化乙锭 1TAE 溶液染色约 20 min,再用清水漂洗 10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA 存在则显示出红色荧光条带 ,采用凝胶成像系统拍照保存琼脂糖凝胶电泳步骤 2006-10-24 17:21a)用高压灭菌指示纸带将洗净、干燥的玻璃板的边缘( 或电泳装置所配备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶模。将胶模放在工作台的水平位置上(用水平仪校正) 。b)配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液（通常是 1x TAE 或 0.5xTBE)。在已加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶或瓶盖未拧紧的玻璃
16、瓶中加入准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的 50容量。c)在锥瓶的瓶颈上松松地塞上 Kimwipes 纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖溶解。d）用融化的琼脂糖封住边界。e）在合适的位置上放置核子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板再近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险破裂后会使样品从凝胶与破璃板之间渗漏。f)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在 35mm 之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。g)在凝胶完全凝固后(于室温放置 3045 分钟)，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将疑胶放入电泳槽中。h)加入恰好没过胶面约 1mm 深的足量电泳缓冲液。i)DNA 样品与所需加样缓冲液混合后，用一次性微量移液器，或者只要手不至颤动，亦可使用巴斯德吸管慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中.
