1、教谢学位论文独创性声鲷本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。义中依法引用他人的成果，均融做出嚷确标淀或得到许可。论文内容来包含法律意义上已藩予毽入戆强舞形式熬戮究残采，錾举奄含奉久基髑予箕建学位串请鹩论文袋戏采。本人如造反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。论文作者繁名：未毒乏蜃屯 嗣期：力哆年月日学位论文知识产权权属声明本人在母师指导下所究成盼学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。学校享有浚锾簿方式发表、复髑、公嚣鬻夔、蓿蕤戮及串请专拳等投蘩。本久离校后发表或使用学位论文或岛该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛大学。零学整论文嚣予：保密
2、口，在不保密酲。年解密后适用于本声明。（ 请在 以 上 方 酗 内 ”逡文穆誊麓 袈商 。秘 打 七翟 瓣麓：雩筝；莠羁导耀签名；趔讯 躁期：二聃年 月多墨（本声明的版权归青岛犬学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用）势引言引 言真菌性角膜炎是一种由致病真菌引起的感染性角膜病变，对眼组织的破坏极为严重，致盲率极高。近年来由于激素和新型广谱抗生素的广泛应用以及配戴角膜接触镜、免疫抑制剂的使用及对本病认识和诊断水平的提高，真菌性角膜炎的发病率呈逐年增高趋势。目前临床上尚缺乏针对该病的有效预防措施及治疗方案。因此探讨其发病机制，研究其有效的治疗措施，对于真菌性角膜炎的治疗意义重大。年和首先
3、在蝌蚪的皮肤中发现家族的第一成员一胶原酶，后来一系列的家族成员陆续被发现，并日益受到学者们的关注。目前研究发现删 在各类眼疾病的发生与发展中具有重要的作用，本实验将采用技术分析真菌性角膜炎及正常角膜中胁一的表达的差异，以便从分子水平揭示真菌性角膜炎的发病机理。是的一种选择性抑制剂，在一些相关研究中发现能够特异性抑制删卜的表达。目前研究证实基质金属蛋白酶特别是在真菌性角膜炎中发挥着重要作用。作为基质金属蛋白酶家族中的型胶原酶，能降解以型胶原为主的细胞外基质，导致炎症的加重，主要参与以型胶原为主的角膜基质的降解丢失，与角膜基质的降解程度呈正相关。本实验采用技术分析了真菌性角膜炎干预前后角膜组织中表
4、达的变化。青岛大学硕士学位论文材料与方法实验材料实验动物健康新西兰大白兔（ ，）只，购于山东省农科院研究所， 月龄，体重，雌雄不限，双眼角膜正常，于青岛大学医学院附属医院动物实验室（级）饲养。实验动物及实验条件均符合国家科学技术委员会的 实验动物管理条件 。实验主要试剂及耗材动物模型制备所需材料）曲霉菌株（由中国科学院微生物研究所提供）（）丁卡因（）氯霉素（） 微量注射器（带号针头的胰岛素注射器）（） （德国公司，加二甲基亚砜稀释为 ）（） 眼科手术器械一套（包括显微剪刀、显微镊子、眼科剪、普通镊子、剪刀和开睑器等）组织病理学检查所需试剂（）中性固定液（）丙酮（）二甲苯（）石蜡：（）酒精（、）
5、。（）苏木素（）蒸馏水（）氨水（）伊红。毋中性树胶 所需试剂及耗材（）、一步法组织总提取试剂盒（公司）（）、 试剂盒（公司）材料与方法（）、聚合酶（公司）（）、头： 。 ，（）、 管、 反应管（）、：取放入量筒，加入纯水至倒入烧杯中用玻璃棒搅匀后保存备用。（）、溴化乙锭（）（中国医学科学院血研所科技公司，分装）（）、 溶液：取，用双蒸水溶解后，加入（），加入冰乙酸，加双蒸水至，摇匀，配制成溶液储存。用时稀释为溶液。（）、琼脂糖凝胶（西班牙琼脂糖）：称取琼脂糖加入 溶液摇匀，放入微波炉，中火分钟，取出摇匀，再中火分钟。放置至微烫手后加入朗溶液，摇匀后插梳灌胶，半小时后拔出梳子。毋、：（）北京鼎国
6、生物、上样缓冲液： 主要仪器（）、高温高压灭菌仪： 一、（）、一 冰箱（青岛澳柯玛公司），一 超低温冰箱（）（）、旋转切片机（）（）、生物显微镜（日本），显微照相机（日本）（）、微波炉：顺德市格兰仕电器实业有限公司（）、低温离心机（，）（）微量离心机（ ，）（）、振荡器： （）、恒温箱： 、高速匀浆器（、紫外分光光度计、电子秤：腿，）、制冰机： 公司、超净工作台（：加） 、微量加样器：、珊、微量加样器各一把，（德国公司）青岛人学硕士学位论文、仪： ，彻、水平电泳槽 （ ）、紫外线图象成像系统（ ，）毋、数码相机（日本）、裂隙灯显微镜：苏州医疗器械厂实验方法动物模型的建立与标本的获取实验分组将只
7、新西兰大白兔随机分为组：组只兔为对照组，不接种真菌。组只兔为真菌性角膜炎组，接种曲霉菌，接种曲霉菌后不予治疗处理。组只兔为真菌性角膜炎治疗组，接种曲霉菌后立即给予溶液（ ）点眼，次日。选定右眼为实验眼，实验前用裂隙灯显微镜检查实验兔眼角膜正常，无眼前段病变。真菌性角膜炎动物模型的建立（） 下将获取的曲霉菌株接种于沙堡氏培养基小时。（）用无菌生理盐水将其配成的真菌混悬液，备用。（）选择健康新西兰兔，雌雄不限，右眼作为接种眼。“）兔眼用丁卡因点眼表面麻醉。（）开睑器开睑，接种前清洁结膜囊，用棉签拭去眼表多余水分。（）用微量注射器（带号针头的胰岛素注射器）从周边穿至中央浅层基质注射，每角膜实质接种菌
8、液 （含个茵数），形成一直径大小的白斑。（）接种后每日给予氯霉素滴眼液滴眼，次日，抑制细菌生长，每日观察并记录角膜情况。（）组于接种后立即给予溶液（ ）点眼，次日观察方法接种后每日用裂隙灯观察实验兔角膜情况，并于接种后、拍摄照片。标本的获取 ，（）分别将、组各只兔于接种曲霉菌后、，、材料与方法（每个时间点只兔）耳缘静脉空气注射栓塞处死。（）无菌条件下按手术步骤摘除兔眼球，获取角膜组织，将其一分为二，一半用快速固定，另一半放入经过高压消毒并且处理过的管中，立即置于 深低温冰箱保存（手术操作过程中均避免核糖核酸酶和其他物质污染）。组织病理学标本的制备切片制作（）固定脱水透明：标本于中性固定液中固定
9、，梯度丙酮脱水，二甲苯透明 分钟；（）包埋： 浸蜡过夜，石蜡包埋：（）切片：从中央角膜开始连续切片，切片厚度为微米，每隔 取片组织切片；“）脱蜡：烘干后二甲苯脱蜡分钟。常规染色：（）石蜡切片经二甲苯常规脱蜡后，梯度酒精（、）入水；（）苏木素染色分钟；（）蒸馏水冲洗分钟；（）盐酸酒精酸化数秒钟，流水冲洗，氨水中止酸化；（）泊来水冲洗分钟，蒸馏水洗次；（）伊红染色 分钟：（）脱水：、酒精各脱水分钟；（）透明：石炭酸二甲苯分钟，二甲苯分钟；（）中性树胶封片：光镜下观察组织结构变化以及炎性细胞浸润情况。 ：实验前准备将实验用管、却头、管等耗材均高压消毒半小时。引物的设计与合成：从中查出兔基因全序列，并
10、查找基因序列作为内参照，应用软件，设计引物。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，序列如下：青岛大学硕士学位论文引物序列引物序列。卫口噙弼九钆蛆 （上游） （下游）扩增产物长度为 田舶 （上游） 诅 （下游）扩增产物长度为以上引物使用时用无菌去离子水配成。组织总的提取（）按角膜组织 加入后，室温放置，使其充分裂解；（注：组织体积不能超过体积的）（）匀浆：用电动匀浆器充分匀浆约卜分钟；（），离心，弃沉淀；（）按氯仿加入氯仿，振荡混匀后室温放置；（注：禁用漩涡振荡器，以免基因组断裂）（） ，离心；（）吸取上层水相，至另一离心管中；（注：此过程一定不要吸取中间界面和下层酚相）（）按异丙醇 加入异丙
11、醇混匀，室温放置：（） ，离心，弃上清，沉于管底；（）按 乙醇 加入乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；，离心，尽量弃上清；室温晾干或真空干燥；（注：样品不要过于干燥，否则很难溶解）用超纯水溶解样品， ，：将提纯的迅速置于 深低温冰箱中保存，备用。注：（）组织量过少，可酌情减少用量。（）组织量过多，会引起对的污染。（）夏天提取时必须戴手套，手是的主要来源。测量的值分别取铷所得样品，加超纯水稀释，用紫外分光光度计测定出）笳。和舳值，计算捌比值。稀释倍数浓度（ 皿），来测定所提取样品的浓度及纯度。测得瑚比值均在至之间，证明所提取的样本无蛋白质和污染含量计算方材料与方法法：若缌织中提取总的值为；则禽薰
12、，一步法反应反成体系本实验将扩增鼹慰辱耱，懿栗敷入弱一反庭体系孛，嚣在弱一反应体系孛露畦扩增律为肉参照的和待铡静秘的基因，由予奁嘲一反应俸系巾应用两对引物问时扩增两种目的基因，极易出现非特弊性扩增条带。因此，可将两对引物分别置于两管中，用棚同的体系和优化的反应条传进行扩增，既可以避免两者的穗互影穗，又苓影嫡拳定量懿结采。嚣筵，按照试裁说骥蓦鬟供豹参考矮豢及终浓度范围，分别于两个 【 反威管中加入表、所示试剂，制备反应混合液，混匀，然后分装，按照所计算含量分别在每管中加入，样品。袭。 爱霾警孛黪爱瘟搏系青岛大学硕士学位论文表 ，反应管中的反应体系反应条件的优化本实验将扩增两对引物，并进行半定量分
13、析，因此，应尽量将两反应管中的条件统一起来，即将各成分用量统一，并尽量选择同样的退火温度及反应的循环数。反应管中，、酶、引物浓度等其它条件均按照试剂盒规定的标化条件范围进行；而两管的各成分加样时采用先混合加样，然后分装，最后加入引物的方法，这样可以保证两管中成分有相同的浓度。对不同退火温度进行优化时，分别选择 、 、 、 和 进行试验，结果显示退火温度： 和为 时扩增条带较为理想，退火温度较低则容易出现非特异性条带，过高则扩增条带减弱或无特异性扩增条带。对于循环数，从个循环开始，每增加个循环取扩增产物进行检测，共进行个循环，电泳结果显示和删 个循环时反应管中的反应体系均未达到平台期，而又能比较
14、清楚的显示。因此 和删一选择循环为最佳循环数。经过上述优化过程，本实验最终采用的反应条件为： 逆转录， 预变性，然后 变性， 退火， 延伸，共个循环，最后 延伸。 产物的电泳分别取反应管中产物各 ，加入预先配制好的上样缓冲液 ，于琼脂糖凝胶中电泳，直流电压，分钟，凝胶用紫外线图象成像系统观察，并进行半定量分析，每份标本均观察到的扩增条带、的特异性扩增条带，证实逆转录所得的的完整性以及反应成功。统计学分析材料与方法应用 统计软件，对半定量各组嘲基因的相对表达量进行统计学处理，采用方差分析，处理组两两比较采用检验；对干预前后基因的相对表达量进行统计学处理，采用检验。结果结 果实验动耪模型静获撼接种
15、后。兔一般状况良好，无死亡。接种后，组新西兰丈白兔只服全部发病，表现为结膜充血、水肿，接种麟，肉目鼹观察可见到不同程度的角膜溃疡薅凝，凌瘀潺获大，、苓簿。薅霹霾逡藤，溃疡瑟我壤大，出瑷魏魔辍藏窝免疫巧形成。在接种厢天部分魄眼还出现角膜穿孔现蒙。干预缎（组）也溆现不同程度的角膜溃疡，但炎症反应较缀轻。组织病璎学结果光镜覆察；接静君灭，染色麓角貘溃疡孛，孙土皮藕蓍弹力屡缺知，基葳浅朦胶原纤维排列紊乱，大缀中性粒细胞没润（见图）；接种后天，角膜水肿加黧，可见整个基质层大量中性粒细胞浸润，胶原纤维排列紊乱（见阔）；接种质天，部分兔爨瑷角貘穿魏，基曩严重窳黪，胶露终缭琢死残落，大量孛毪耱缨臆浸润，后弹力
16、层及内皮细胞缺如（见图）；焦膜基质层可见大量菌丝和孢子，菌缎穿行于胶原纤维之间生长。（见图），结莱 （）爨辩照受貘和筠倒真蘩毪囊貘炎惫搂筑缓串璃捡测到了内参爨基蠢的稳定表达，产物电泳可见纂因片段产物（长度为），诚实逆转录所得的完整俄，且反应成功。（）在铡瓣照及、缀蚌相受爱貘维织孛来捡溅到鞋孵一 戆表达，缀在接种真蒲后开始粥现舻一 的表达，产物电泳可觅瓣 基戳片段产物祭带（长度为），并随时间延长含量增高，各时间点比较差异肖恩蔫性（ ）。（）维与转缀跑较，瓣程君，务辩穗袭达赘显洚戴，差异有显著镌（）。（）例正常兔角膜组织及例真菌蚀角膜炎角膜中基因的表达：经过上述过程蓐，其毫泳结果经紫终线图象残像系
17、绫分辑（冤图。），检测溅卜酾基戮产物条带静获度以及计冀两者静磁值（朝撇的襁对表达量），结果如表表真蓥性囊貘炎维秘正鬻对照维 隧。 戆稚簿裳达重组别。对照缀接种例数平均相对表达量 承艇班 青岛大学硕士学位论文接种接种接种接种接种接种 （）首先利用 进行方差分析，各组之间差异有显著性（卢），然后对各组之间进行两两比较，结果如表。表处理组两两比较检验结果对比组第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第第与第两均数之差咖印舳帖。：如淼黜黜勰黜黜零黜册黜结果由以上可以看出：对照组正常角
18、膜组织及、组时相角膜组织中基本未检测到删的表达，在接种真菌，时后出现一 阳性表达，随时间推移表达量逐渐升高，至天维持在较高水平。（）干预治疗后，组角膜中基因的表达：经过上述 过程后，产物电泳结果可见基因片段产物（长度为）和基因片段产物（长度为）（见图）。其电泳结果经紫外线图象成像系统分析，检测和基因产物条带的灰度以及计算两者的比值（即的相对表达量），结果如表：表真菌性角膜炎组和干预组一 的相对表达量利用 对干预组和角膜炎组基因相对表达量进行检验。组与组比较，组与组比较，组与组比较，组与组比较，组与组比较，方差齐，：，方差齐，；，方差齐，；，方差齐，；，方差齐，；组与组比较，方差齐，；说明两者之
19、间的差异有显著性，即接种后干预组角膜组织中的表达较角膜炎组明显降低。讨论讨论真菌性角膜炎是一种由致病真菌引起的感染性角膜病变，对眼组织的破坏极为严重，致盲率极高，近年来由于激素和新型广谱抗生素的广泛应用以及配戴角膜接触镜、免疫抑制剂的使用及对本病认识和诊断水平的提高，真菌性角膜炎的发病率逐年增高。目前临床上尚缺乏针对该病的有效预防措施及治疗方案。因此探讨其发病机制，研究其有效的治疗措施，对于真菌性角膜炎的治疗意义重大。迄今已发现余种真菌可引起角膜感染，主要分为丝状菌（如镰刀菌属、曲霉菌属、青霉菌属等）和酵母菌属（主要为念珠菌属）两大类，引起角膜感染的不同菌属在不同地区差别较大且相对集中，我国以
20、镰刀菌属和曲霉菌属为主，其中大部分地区镰刀菌是首位致病菌，占；其次为曲霉菌，占，由于致病菌种侵袭力不同以及个体免疫差异，不同菌种感染的患者临床表现差别较大。以往认为丝状菌尤其是镰刀菌感染病情较重，菌丝早期向眼内穿透，常引起穿透性角膜炎和真菌性眼内炎；酵母菌感染病灶局限，较少向基质深层浸润，预后较好。然而我们在近年的临床工作中发现，曲霉菌的致病性也较强，易于穿透角膜，与 等的研究结果一致。因此本实验对曲霉菌引起的真菌性角膜炎的发病机制及治疗进行了实验研究。基质金属蛋白酶（，咿）是近年来发现的结构与功能相关的含锌肽链内切酶家族，来源于多种类型的细胞，至少由种能降解细胞外基质（ ，）的酶类组成脚。生
21、理条件下其合成与分泌主要通过自分泌或和旁分泌的生长因子及细胞活素来调节。根据其结构和作用底物特异性分为五个亚族：（）胶原酶类（）：姗、和一；是目前已知酶中惟一能在细胞外闻隙的中性条件下降解天然型胶原三螺旋的酶。（）明胶酶类： （）， （姗）；可降解变性胶原（明胶）及、型胶原。（）基质水解酶类（）：、跏：可降解蛋白多糖、纤维连接蛋白、层粘连蛋白（）膜型基质金属蛋白酶：，灯一卿；（）其它：岫、脚、咿一、姗、一、删、删。用预测氨基酸序列，表明一些哺乳动物家族成员在结构上含有多个高度保守的结构域序列。这些结构域是前肽结构域、信号肽、催化结构域、凝乳酶样结构域、跨膜结构域等，通过其中某个区的增减修饰而形
22、成不同的。其中前肽结构域中的半胱氨酸维持着基质金属蛋白酶的酶原形式，在酶原激活过程丢失。；催化结构域除结合位点（由序列构成），还含有一个 ”结合区域，结合 ”才能维持酶的活性状态。除外，其他所有都含有血结合素样或样碳端结构域，它的作用可能是决定结合底物的特殊性。在的羧基端存在一个跨膜结构域，将酶定位于细胞浆膜上。从端开始，删卜依次包含以下结青岛大学硕士学位论文构域：信号肽、前肽结构域、倦化结构域、羧端结构域。信号肽为前露序列，引导细藏凄台藏熬多获转移羁内缓秘，季等其残熬瓣信号获郝分棱降解。翦歉旗擒域失裹凌绦守的含半胱氨酸残基的序列，该半胱氨酸残基能阻断酶的 “活性中心与底物的结合，形成 “半胱
23、氨酸闸 ”，使酶原处乎无活性的状态：通过裂解半胱氨酸残基妇飘闯鲍结合撂嚣 “半璇氨黢阕 ”，簸嚣暴露出活性中，扩，酶原被激活。健化续麴域含有一个蠹歉 层、三个单环、两个离子及一个离子，共同构成了酶的特异性。两个 ”离子中的一个具催化活性，通过三个残基束缚程序列巾，是酶活性所必需的辅助因子，可促进酶与底物结合：另一个为结构性 ”。羧端隰奄鑫红素蛋鑫爨骞露源毪，该臻稳壤寿多今残基，惫禽霆令豢毋残墓鹃重复黪翔，决定底物特异饿，并参与调节枷盱一与之间相互作用。删（ ）烧成纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞等细胞来源的成纤维缨胞型胶原酶。以酶旅形式分泌，斑绎维蛋自溶惩酶激活胶麟酶原，使箕鼢麸 酶为 ，德酶活性
24、较低，基质溶解豢壤续在位熹切割使进一步降为 ，从而完全激活胶原酶，这时酶活性提高近倍。胶原蛋白怒构成角膜的童蟹成分，占角膜干重的。角膜基质朦中主要含有燮荻覆，夯含鸯少量、 ￥ 壁葭蒙等， ￥ 鍪蒗蒙分；器予整令受貘旗震。惫貘土皮蒎底膜的主要成分为、型胶原，麟弹力膜中也禽有型胶暇 “。在机体的生长发育和许多病理过程中，主要与细胞外基质的破坏和重塑有关。谗多角膜瘸交如圆锥角膜、与类风瀑痰稳关的周边溃疡性角膜炎、耱尿病性强液瘸交、角膜新生血管、翼狡胬巍霹危貘缀织侵袭等发囊发震过程稳与有笑。谶年来这方面的研究逐渐受到重视，而对活性表达的干扰更为斑膜病变的治疗提供了一个有麓广阔前景的途径。已毒磅究发凌，
25、巍黔等翅簇基痰溶瓣密甥辍关，遥重酶鳃缀戆努藿震，导数角膜溶解嘲。角膜组织中涮童簧包括溉卜（胶原酶），胁（明胶酶），（藻腹水解酶）和（明胶酶）叭 ”戗亦有研究表明在角膜组织中无明胶酶液达 ”。它们律羽的底物虽鸯一定的重叠，键胶原酶主爱作用于闻质胶原（、珏、搿蘩荻骧）；鳙蔽酶终用主要是渍豫交经瓣胶霖帮 激胶骧；基菝墩簿酶求簿疯搦比较广泛，能水解许多激白如蛋白聚糖、明胶、型胶原；膜缴基质金属蛋囱酶的最主要缴物学特征怒它能激活明胶酶（）。潮卜与潮卜蠢诲网捧照；又霹戮罐强潮卜秘潮卜豹矮魏 。我们通过等分予生物学方法，对兔真菌锻角膜炎进行研究，发现其巾的删 表达明显离于正常兔角膜，提示表达水平的升高与兔真
26、菌性角膜炎敢发病密切相关，箕袭达舞高可熊参与真菌性角膜炎的发生鬈发展。疆酶藤豹形式壹按分泌雾陲戆强簇震，萁表达赣活毪在不鬻缁貔承平受翻讨论严密的调按，主要包括以下几个方西（）细胞因予、生长因子和激素等调节转录水平基因表达。（）酶藤豹合残窝分泌。（）溱羚蓥嚣在特殊缀绞缨魁类麓懿选择性表达。（）蛋白质水平酶原的激活和酶活性的抑制。酶原的活化途径概括起来有四个方面，即缳白水解活化、构型改变潘化、巯基转换溪纯：及氧化添证 “”。一旦被激活，其活性的控铡有赖于弱鄢缀织型基旗鑫属蛋白酶撺剃裁（ ，）及其它特异性蛋白酶抑制剂的浓度。已知在正常角膜组织中禽有血清蛋白酶抑制剂 一抗胰蛋白酶、 垂臻蛋鑫及至少一静
27、霉瓣。疆撬羧爨鑫蘩叉稳洚 蛋鑫酶臻割裁，主要霉麴涮孛性粒细胞弹性蛋白酶的活性，在炎症殷应时可保护角膜免受降解。卜抗胰蛋白酶可存在于多种眼组织中，在角膜上皮、基质、内皮三艨中均含有 抗胰蛋白酶，凰上皮缨胞可豢接合成卜抗获蛋白酶。角膜组织中另程一秘特殊的缀自酶抑制剩：珏巨球蛋自，这是一静多功缒静搀涮裁，掰季窜裁西个妻簧酶簇：丝氨酸蛋白酶、金簇凝自酶、天冬氨酸蛋白酶及巯基蛋白酶中犬部分蛋白酶的活性。 巨球蛋白可能是保证角膜免受蛋白酶降解的关键成分，因为它不仅可抑制组织蛋白黼的活性，还可抑制寒鑫缨蘩、瘫毒、毒生痰熬蛋鑫酶滔键。除内源性抑制物井，还有许多外源性物质可抑制脯韵活性，包括强的松、四环素、甲孕
28、酮，乙酰半胱氮酸、枸橼酸钠，维生素等。人工合成的肽类抑制物也取得穰大进展，骰括巯基默、羧基敖等。 是合成歉类涮抑制荆，又称，为一静羧氮羧修镣兹二骏，其撺麓力为巯基簸靛倍，是蠲翁已知效力激强的抑制剂 ”。的作用机制是与酶分子中的底物识别部位绪合，并在酶的活性中心与催化所需的 配位，抑制其活性，从而直接抑制了删对角膜基质股原成分戆酸坏，爨麴裁了角貘滚鼹夔发生窝遴震。赣毽簿羝颥粒镶囊缓戆懿菠滤，其机制可能脊两方面 “：（）颗粒性自细胞向结缔组织内移动、浸润需要硼韵辅助，以裂解颗粒性白细胞周围的基质胶原。因此，抑制了的活性就抑制了颗粒性白细胞蛇穿通和移动。（）胶原蛋白的裂解片段是颗粒性白细臌的趋化因子
29、。被激活豹赫辩搿酶解荻藤蛋彝形藏冀凌，这蓬蛋自冀羧扩散至受貘缘嚣，可辘魏鬏靛性白细胞的移动。颗粒性白细胞经受损的角膜基质胶原达角膜后，即释敝咿造成角膜组织的进一步破坏 “缸。可通过抑制的活性予扰这一反馈机制，进而抑制有趋纯律角豹黢原袭鳃冀段黪产生，舞接魏簿坻了颓粒魏囊蘩戆熬浸溺。除可在酶蛋随水平抑制的活性，减轻角膜上皮熬底膜和基质胶原的降解以及由此造成的细胞浸润以外，邂可通过抑制缃膜组织中一魑炎性细胞因子的表达，减辍炎症反应，保护角膜免受破坏 “时。 “曾报道燃的表达受到多种医子魏鑫缨蕤奔素一（，），转化生长蠢子一塾（青岛大举獭十学位论文，）等的调控： 促进的表达，卜乒抑镱蒺表达。卜怒炎经缨臆
30、因子之一，蓄毙壅荸孩缍戆串绳取出来，分为珏参两令叛藿，具有许多生物学活性调节细胞及组织代谢、炎症及创伤愈合过程。现在己知许多细胞如上皮细胞，成纤维细胞，可以产生 “”。卜可以使角膜上皮细胞产生巨噬缨骢炎性戮予（麓一），蘩卜是佟麓极强豹趋诬辫予，霹镬大鬃蠡纲您送入恁貘，并且介导卜、一、等细胞因子和蛋白质的表达，上述细胞因子升高促进炎绷胞浸润，释致角膜炎的发生 “”。等 “”观察可明照抑制自细胞介索 ，自细胞介素一 、囱细胞介素一袭达。从而抑制的表达。我弱遴逶等分子生魏学方法，对受冀蓦往角貘炎遗移研究，发瑗干预后，角膜中 表达明驻低于真菌性角膜炎未干预组，证明能够抑制真菌性角膜炎中的表达。由上述霹
31、霓，巍 在真蓥性角膜炎的发生巍发震过程中发擦着重要静终惩，它参与了真菌性角膜炎的发生与发震，能够抑制真菌性角膜炎中一的表达及活性，并且对于角膜细胞及组织毒性小，有望成为临床治疗角膜溶解的理想药物，联合上皮生长因子，纤维连接蛋白及抑肽酶更有利于角膜损伤的修复。这将为真薤经角膜炎瓣潼疗羹定蘩实静基稿。以上研究结果为真菌性角膜炎的犟期非手术治疗开辟了广阔的前景。结 论真菌性角膜炎是以真菌菌丝和孢子侵入及中性粒细胞浸润为主的广泛化脓性炎症。正常角膜中基本未检测到的表达，在接种曲霉菌小时后删表达逐渐增多，至第天维持较高水平。删一在真菌性角膜炎的发生和发展中发挥着重要作用，其机制可能为降解角膜基质中的型胶原，导致角膜基质的降解丢失。能够抑制真菌性角膜炎中的表达，其机制可能是可明显抑制白细胞介素一 、白细胞介素 、白细胞介素一等因子的表达，从而负性调节的表达，还可与肝一酶分子中的底物识别部位结合，并在酶的活性中心与催化所需的 配位，抑制其活性。
