1、2012 综述现代波谱分析的进展班级：080213 姓名：邓永华摘要：波 谱 分 析 主 要 是 以 光 学 理 论 为 基 础 ， 以 物 质 与 光 相 互 作 用 为 条 件 ， 建立 物 质 分 子 结 构 与 电 磁 辐 射 之 间 的 相 互 关 系 ， 从 而 进 行 物 质 分 子 几 何 异 构 、立 体 异 构 、 构 象 异 构 和 分 子 结 构 分 析 和 鉴 定 的 方 法 。 它主要包括：紫外可见光谱、红外光谱、核磁共振、质谱、荧光光谱、拉曼光谱等。本文对现代波谱分析的新方法、新成就及新应用进行简要的描述。关键词：波谱法，紫外可见光谱，红外光谱，核磁共振，质谱，进
2、展，应用一、紫外可见光谱法紫外可见光谱法（也称紫外可见分光光度法）是根据溶液中物质的分子或离子对紫外可见光的吸收程度来确定物质的组成、含量，推测物质结构的分析方法。其应用非常广泛：用于定量分析，定性分析和结构分析；无机和有机物的分析，配合物的组成及解离常数的测定等。1 紫外可见光谱法的研究进展1.1、 动力学光度法。催化动力学光度法因其灵敏度高所需仪器设备简单而始终保持快速发展的势头。其测定范围包括无机物、有机物,特别是生物和药物分析中得到较多应用。例如在邻苯二甲酸氢钾- 氢氧化钠介质中,以钴( ) 催化过氧化氢氧化DCF 偶氮胂的褪色反应为指示反应,测定中草药样品中的钴,方法的检出限为216
3、 10 - 12 g/ mL。利用催化反应的激活或抑制作用和酶法进行动力学光度法测定,扩大了方法的应用范围。1.2、 固相光度法。将有色结合物吸附或萃取在固相离子交换树脂上,再在固相进行光度测定,往往是分离和富集同时完成,也可在高效液相色谱和流动注射分析中应用,利用导数技术可降低或消除噪声的影响,方法简单、快速、灵敏度高、选择性好、易于实现自动操作。固相分光光度法作为一种新的痕量分析手段正在兴起,不断研究出新的固相载体,与其它技术联用更是增强了它的活力,拓宽了它的应用范围。1.3、 液相色谱和毛细管电泳光度检测。光度法是液相色谱及毛细管电泳最常用的检测手段。毛细管电泳法是一种高效液相分离法,是
4、经典电泳技术和现代微机分离相结合的产物,与传统的分离方法相比,它的显著特点是简单、高效、快速和微量。而紫外- 可见吸收是毛细管电泳中应用最广泛的一种检测手段。如用毛细管电泳紫外检测法同时测定复方芦丁片中芦丁和维生素C 的含量, 检测下限分别为01002 mg 和0101 mg13 ,用于实际样品测定。灵敏度不高是紫外- 可见吸收检测法的主要缺点,这主要是光程太短造成的。2 紫外可见光谱分析法新应用2.1测定监测反应过程。用差示分光光度16 法研究生物大分子与配基之间的相互反应。差示分光光度法所得的差示光谱,既可用以分析生物大分子与配基之间是否发生反应,提供定性的证据,也可对这种反应进行定量分析
5、。只要测出max , 以及max 时的A。除此之外,许多大分子物质也用此方法研究。配基种类多种多样,包括辅基和辅酶以及一些金属离子。2.2在核酸分析中的应用。核酸、核苷酸及核苷的组成成分中均含有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键，因而它们都具有吸收紫外光的特性，能吸收250-290 nm波段的紫外光，最大吸收波长在260nm 波长处。利用紫外分光光度法定量测定核酸时，规定在260 nm波长下，每毫升含1微克DNA 溶液的吸光度为0.020，而每毫升含 1微克RNA溶液。吸光度的比值可判断样品的纯度。利用分光光度法还可以定性鉴定核酸的纯度。为增强紫外分光光度法测定核酸的准确度，很多人使用有机
6、染料与核酸作用，通过核酸对吸光度的减色作用来测定核酸。作用机理是有机阳离子试剂以静电引力的方式与DNA上带负电荷的磷酸基相互作用, 使有机阳离子发生电荷跃迁的几率减小,导致吸光度减小。2.3.固态紫外光谱法在炼油催化剂表征中的应用.紫外光谱是催化材料谱学分析的基本手段，应用紫外光谱法测定固体，通常被称为固态紫外光谱法，其主要应用是化合物的定性分析和结构分析。此外，可以配合红外光谱法、核磁共振波谱及质谱等结构分析法进行定量鉴定和结构分析。紫外荧光光谱分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展，方法灵敏度、准确性和选择性日益提高，应用广泛，逐步发展成为催化剂表征中一种重要而有效的光谱化学分析手段
7、。紫外光电子能谱（+L,）使用紫外能量范围的电子激发样品原子外层的电子，用于分析样品外壳层轨道结构、能带结构、空态分布和表面态情况。在化学态表征中，紫外可见光谱（+7 ; 7BG）的漫反射谱提供了过渡元素原子的配位情况，但基本上是定性表征，多用作其他技术表征的佐证。二、 红外光谱分析法根据试样的红外吸收光盘进行定性、定量分析和确定分子结构等分析的方法，称为红外吸收光谱法。红外光谱分析技术被誉为分析化学领域的巨人，已成为发展最快、最引人注目的光谱分析技术之一。在国外，定性、定量分析所使用的近红外光谱分析仪器已走过了50年的发展历程，并且在不断完善的过程当中;我国的近红外光谱仪器的研制仅仅历经20
8、年的时间，虽然处在起步阶段，但近几年的研究成果还是十分显著的。1、红外光谱分析法的研究进展1.1红外光谱法在中药研究方面的进展中药具有重要的红外光谱特征。红外光谱在快速、无损和准确研究中药方面表现出巨大的潜力。综述了红外光谱特别是近红外光谱和傅立叶变换红外光谱技术研究中药的最新进展，全面叙述红外光谱技术在中药定性定量检测、新药开发和中药药理研究方面的应用情况。1.2 ATR技术与高分子材料表面成分分析ATR(attenuated total refraction，衰减全反射)，作为红外光谱法的重要实验方法之一，从一开始便显示出其独特的优势和广阔的应用前景。由于其并不需要通过透过样品的信号，而是
9、通过样品表面的反射信号获得样品表层有机成份的结构信息。不但简化了样品的制作过程，而且极大地扩大了红外光谱法的应用范围。使许多采用传统透过法无法制样。或者样品制各过程十分复杂、难度大、而效果又不理想的实验成为可能。因此，被广泛应用于塑料、纤维、橡胶、涂料、粘合剂等高分子材料制品的表面成份分析。1.3 FTIRATR分析技术与纺织化学与染整工程80年代初将显微技术应用到傅里叶变换红外光谱仪，诞生了ATR-FTIR仪，它使微区成分的分析变得方便而快捷，检测灵敏度可达数纳克(ng)，测量显微区直径达数微米。随着计算机技术的发展，实现了非均匀、表面凹凸、弯曲样品的微区无损测定，可以获得官能团和化合物在微
10、分空间分布的红外光谱图像。红外光谱仪定性鉴别纺织材料主要是利用各纤维特有的官能基团的特征峰进行识别,采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)则可从分子结构上科学地鉴定纤维。结合傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)的特点，采用点对点采样技术，无需制样和破坏样品，可直接鉴定纺织纤维。与以往的ATR技术相比较，该方法无需调整光路，操作方便，只要将样品直接放在ATR附件上就可以直接测量，且测量灵敏度大大提高，可得到高质量的红外光谱图。与常规的光谱方法(显微红外技术FZT010571999方法等)相比，该方法更直接快速，并且不损坏样品。2、 红外光谱分析法新应用2.1 在食品掺假检验中的应用 奶
11、制品掺假鉴别. 王彩云等人采用多元散射校正作为光谱数据的。预处理方法，结合偏最小二乘法(PLs)建立牛奶中氯霉素残留的定量分析校正模型，并用所建模型对预测集样品中的氯霉素含量进行预测，取得较好的效果。多元散射校正预处理方法可有效地消除牛奶在非均质状态下的特殊性以及样品内部成分颗粒大小的分布不均匀而造成的光谱差异，PLS能较好的解析近红外漫反射光谱严重蕈叠现象，解决各组分干扰问题。2.2 在金属氧化物纳米材料研究中的应用 研究金属氧化物纳米材料红外吸收特性。纳米金属氧化物，对红外电磁波的吸收体现出吸收峰强度高、频带宽且吸收峰随材料的晶型结构和粒径有不同程度的蓝移和红移的特点。如果进一步对纳米材料
12、进行复合，即可达到宽频带吸波的要求。三、核磁共振波谱分析法将自旋核放入磁场中，用适宜频率的电磁波照射，它们会吸收能量，发生原子核能的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振谱，这种方法成为核磁共振波谱法。近20年来，随着超导磁体和脉冲傅里叶变换法的普及，NMR的新方法、新技术不断涌现，如二维核磁共振技术、差谱技术、极化转移技术及固体核磁共振技术的发展，使核磁共振的分析方法和技术不断完善，应用范围日趋扩大，样品用量减少，灵敏度大大提高。1、核磁共振波谱分析法的研究进展1.1 固体NMR 与材料科学针对固体化学位移的各向异性及自旋晶格驰豫时间很长的缺点,采用交叉极化魔角旋转(CP -MAS) 技术
13、,通过样品的高速旋转、旋转轴与磁场方面夹角为54. 7 以及交叉极化等方法,使以上不足之处得以顺利解决,使NMR 在材料科学、矿物分析、表面吸附、聚合体陶瓷等方面具有独到的优势。1.23DNMR 与结构生物学3DNMR 是2DNMR 技术的发展,它主要应用于测定生物大分子尤其是蛋白质的三维结构,通过肽连接把一个氨基酸残基上的1H 磁化矢量转移到另一个氨基酸残基,通3DNMR 方法进行序列归属。NMR 方法的精确性可以与晶体X - 衍射成像相媲美,而且NMR 方法的优越性在于测定的是溶液中的结构,从而可以研究对发挥蛋白质功能有重要作用的动力学过程。1.3NMR 成像与医学诊断随着2D、3DNMR
14、 的发展, 人们很快认识到NMR 成像对研究人体和动物解剖具有巨大潜力。由于水含量和驰豫时间的差异,利用适当的NMR脉冲序列就可以区别不同的生物组织,获得有明显不同的正常和病理组织的图像。作为临床许多疾病的诊断工具,其安全性和准确性远优于其它成像技术如CAT。最让人兴奋的是基于顺磁去氧血红蛋白的磁敏感效应来研究局部大脑功能,科学家们应用NMR 连续监测大脑的运动中枢部位的图像的不断变化,以确定该区域的能力,从而为研究人深层次的思维活动开辟了新天地。2、核磁共振分析方法新应用2.1、磁共振波谱分析在的应用。磁共振波谱是迄今为止能无损伤性研究活体肝脏代谢、生化变化及化合物定量分析的唯一方法。磁共振
15、波谱分析是活体检测体内物质代谢及生化物质含量唯一的无创性检查技术，近年来发展迅速，已广泛应用于评价人体组织肿瘤的发生及发展。MRS的发展使影像诊断学逐步深入到细胞生化代谢水平。研究表明，MRS具有很高的鉴别疾病能力，有望成为诊断肝脏疾病的重要工具。脑是MRS研究最多的器官，其临床应用日臻成熟，而MRS在肝脏疾病中的应用才刚刚起步。2.2 研究蛋白质三维结构及功能的应用。核磁共振波谱技术是能够在原子分辨率下测定溶液中生物大分子三维结构的唯一方法。近年来由于核磁共振波谱技术及标记方法的发展，核磁共振方法可以测定的蛋白质分子量为4050KD，用核磁共振波谱方法测定结构的最大的单链蛋白质的分子量已达到
16、82KD。核磁共振技术不仅仅局限于结构测定，它还应用于研究生物大分子及其复合物在溶液中的三维结构和功能、研究动态生物大分子之间以及与配基的相互作用、研究生物大分子的动态行为、用固体核磁共振或液态核磁共振技术研究膜蛋白的结构与功能、研究蛋白质折叠。折叠动力学、研究活细胞中的蛋白质蛋白质相互作用。2.3 在天然药物发现中的应用。核磁共振波谱在药物发现过程中的典型技术主要有化学位移扰动瞳930。，扩散3卜3引，弛豫3135|，NOE效应36-3 9|，饱和转移40i等等依据不同的研究对象，可以对上述这些核磁共振技术进行不同的组合或与其它分析技术、虚拟计算相结合，在活性化合物的筛选方面发挥巨大作用。四
17、、质谱分析法质谱分析法用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片) 按它们的质荷比分离后进行检测的方法。质谱分析法主要包括电喷雾电离质谱法(ESIES)、基质辅助激光解吸电离质谱(MALDIMS)、快原予轰击质谱法(FAB-MS)、同位素质谱法(IMS)等。主要应用进展有以下几个方面：1、质谱在生命科学领域中的应用进展1.1、小分子的分析质谱在小分子上的检测主要是用核素稀释小分子标志物后，采用气相色谱一质谱联用(GC-MS)法对其进行分析。质谱能够测定一些小分子如木质素、酶水解后的混合酶和葡萄糖的含量。质谱法也能够改进细胞色素 P450 亚型基础上的激素的预实验处理方法的步骤，从而
18、提高其检测效率”近年来质谱在脂肪酸中的应用报道也很常见，质谱通过对脂肪酸产物的醛酮结构的分析和定量，能够阐明脂肪酸的转变过程。在具体的分子构象如葡萄糖的立体异构左旋右旋的葡萄糖和手性四糖的结构也能够通过质谱测得。1.2、药物分析质谱在药物分析中的突出优势在于能够方便监控药物在体内过程中发生的变化，分析低浓度范围内的体内药物浓度，阐明药物作用的部位、强弱、时效及毒副作用，为药物设计、合理用药提供实验和理论基础。用质谱检测药物结构准确、快速，几乎可以用于所有药物检测。如在抗癌药上的最新进展显示采用核磁共振和蒸发光散射一质谱联用能够用来对聚集的蒽环类抗生素进行分子动力学分析。而另一项报道显示前列腺癌
19、变细胞中的分裂原激活蛋白能够用质谱进行准确的测定。有报道称结合亲和力纯化技术，使用探针探测各种分析物之间的联系，质谱能用来分析药物中的活质分子和筛选优选引导物。该项研究第一次使用质谱同时进行了药物开发中的体外和体内细胞的药理学和临床实验的研究，是质谱的又一项前沿领域的具体应用。而质谱对微生物代谢产物的分析，能作为一些抗生素药物对微生物分解能力的评价指标。近年来有报道称质谱在表面活性剂的选择、人工血液、新型生物假肢和人工皮肤等的分析上已有应用。蛋白质在蛋白质的研究方面质谱测定内容包括蛋白质的一级结构如分子量的测定、蛋白质组研究、肽指纹图谱测定、肽序列的测定、巯基和二硫键的定位、蛋白质翻译后的修饰
20、等。质谱分析蛋白质组特征对样品的预处理过程要求非常严格，需要考虑到技术的相容性和检测限。与常规的方法相比，在一个多信号途径的单一实验中，质谱能够鉴别所有的磷酸化蛋白，包括它们的磷酸纤维素氨基酸的位置。一些保持蛋白质的完整性的技术已被成功开发，包括多维 HPLC 与电火花电离质谱串联技术、毛细管阵列支持的去吸附去离子化-质谱联用技术等。近年来，肽指纹图谱(PMF)已经应用于新蛋白质的发现。通过对蛋白酶解或降解得到的多肽混合物进行质谱分析，将所得肽片与多肽蛋白数据库中的理论肽片进行比较，根据不同蛋白质所得肽片的指纹特征，从而判别所得蛋白质为已知或未知。微生物检测质谱在微生物的检测方面主要体现在对其
21、结构的测定、生物降解过程和新陈代谢过程的研究。ESI 和 MALDI 技术能在全细胞水平上展开对微生物的分析，直接检测被裂解的细胞，测定其全细胞指纹图谱；质谱也能找出种间和株间特异保守峰作为生物标记。最新的研究成果表明用串联质谱在细菌微粒物的离子交换和电位的测定上取得了突破性的进展。MALDI-TOF-MS 多次被用于检测细菌的降解能力和评估在外界刺激条件下细菌蛋白质组的变化。研究发现：利用质谱对降解过程和光固定后的中间产物的测量，能够评价萘啶酸、喹诺酮等药物在废水处理过程中降解细菌发挥的效用。另外，在新陈代谢方面，能用质谱对其生成酶解产物的反应率和反应途径进行分析测定。质谱技术也广泛应用于食
22、品微生物的检测和鉴定。2、质谱分析方法新应用2.1、细菌的检测与鉴定它能完成细菌多种成分的分析，包括蛋白质、脂类、脂寡糖和脂多糖，DNA，多肽及其它能被离子化的分子。细菌含有一些成分，能给出唯一的质荷比，作为生物标志分子特异鉴定细菌。Demirev 等对蛋白质进行分析，在 4-15KD 范围内利用数据库检索，成功鉴定了枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。2.2、引领分子诊断时代“血清质谱多肽谱”是指通过生物质谱快速分析血清中多肽组精确质量数标示的多肽组，可进一步通过串联质谱分析获得多肽序列，从而鉴定前体蛋白质及其生物来源。已有多项资料表明，血清质谱多肽谱已在恶性肿瘤早期诊断中显示了良好的前景。2.3、病毒
23、的检测与鉴定在对病毒的构成和结构的研究以及对完整病毒的检测方面，质谱技术也逐渐得到应用。将完整病毒颗粒的胰蛋白酶酶解片段不经处理直接进行 MALDI-TOF-MS 分析，成功鉴定了新德毕斯病毒 AR339。采用质谱技术，使用 NRV 的病毒颗粒对NRV 的包膜蛋白进行了完整膜蛋白病毒扫描，胰蛋白酶消化后的蛋白质量图谱和蛋白肽序列的分析，实现了对 NRV 的鉴定。这一研究成果，是质谱技术在快速鉴定人体标本或环境中病毒的应用方面又迈进了重要的一步。参考文献1、 邓秀霞，紫外- 可见分光光度法进展，广州化工，2002 年 30 卷第 4 期2、 薛萍，郑文杰，紫外可见光谱在生物无机化学中的应用，广州
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