1、摘要Ammecr基因家族的系统进化及其在文昌鱼和斑马鱼胚胎发育中的表达摘要文昌鱼是现存与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物类群之一，由于文昌鱼的形体结构及胚胎发育和脊椎动物有许多共同之处，在基因和基因组水平上二者又有很高的同源性，因此文昌鱼是进化和发育生物学等研究的理想材料。近年来，随着文昌鱼实验室连续繁殖获得成功和全基因组测序的完成，极大地推动了文昌鱼模式化进程，以文昌鱼为对象的基因功能研究日益增多，文昌鱼的基因及其表达模式常用于与其他物种，尤其是与脊椎动物之问的比较基因组学和发育生物学研究。相邻基冈缺失综合征(AMME，Alport syndromeMental retardation，Mi
2、dfacehypoplasia and Elliptoeytosis)是由人X染色体上一段序列缺失所致，Ammecrl是位于该缺失序列片段上的基因之一，但该基因的确切功能尚不清楚。数据库搜索发现存脊椎动物中存在2个Ammecr同源基因：Ammecrl和Ammecrll，而在无脊椎动物和细菌中只有一个同源基因。为了探索这一基因的功能，本研究克隆了文昌鱼中Ammecr同源基因，进而对Ammecr基因家族的进化和文昌鱼Ammecrl基因的表达进行了研究。文昌鱼的Ammecrl基因(AmphiAmmecrllI)的cDNA序列全长2,920bp，其中开放阅读框全长为738bp，编码245个氨基酸。将A
3、mphiAmmecrlll与脊椎动物代表物种人、鸡、爪蟾和斑马鱼以及无脊椎动物海鞘、果蝇和线虫的Ammecrl同源基因进行蛋白序列比对，发现Ammecr基因家族成员序列相似度很高，尤其是C端区域：利用蛋白比对结果构建的系统进化树显示脊椎动物Ammecrl与Ammecrll亚家族分别聚成两簇，AmphiAmmecrlll位于这两基因簇的底部，这个结果说明脊椎动物Ammecrl和Ammecrll可能来源于同一个祖先基凶，是基因倍增的结果。然而，在目前所有可用的硬骨鱼数据库中都只找到一个Ammecrl基因，设计兼并引物用PCR方法也只在斑马鱼中克隆到Ammecrl基因；由于目前软骨鱼数据库不完整，无
4、法判断软骨鱼基因组中Ammecrl同源基因的数目，本研究又用同样的PCR方法在软骨鱼代表条纹斑竹鲨中成功地克隆到摘要Ammecrl及Ammecrll，这一结果暗示Ammecrll基因可能在硬骨鱼中发生丢失，而软骨鱼和其它脊椎动物类群中保留了Ammecrl和Ammecrll基因。为了进一步研究脊椎动物Ammecrl4mmecrll的起源问题，我们还比较了数据库中代表物种AmmecrlAmmecrll同源基因的结构，结果显示脊椎动物AmmecrlAmmecrll在外显子大小和数目(6个外显子)上都相当保守，文昌鱼AmphiAmmecrlll(5个外显子)和它们也仅有一个外显子之差，且AmphiAm
5、mecrlll最后一个外显子长度(209bp)恰好与脊椎动物中AmmecrlAmmecrll最后两个外显子长度之和(212bp)相当，推测脊椎动物Ammecrl和Ammecrll基因的最后两个外显子是由AmphiAmmecrlll最后一个外显子进化而来。Ammecr基因分布的广泛性和序列上的高度相似性暗示了其功能上的保守性。为了研究Ammecrl在脊索动物进化过程中是否保留了相同或相似的功能，本实验利用原位杂交和实时荧光定量PCR方法比较了斑马鱼Ammecrl和文昌鱼AmphiAmmecrlll在胚胎的表达情况。结果显示，斑马鱼Ammecrl呈现母源表达特征，在卵母细胞和受精卵中有大量基因转录
6、物。同时发现斑马鱼Ammecrl也存在合子表达方式，实时荧光定量PCR结果显示合子表达发生在大约囊胚晚期；24 hpf时期的胚胎的原位杂交结果显示，表达产物集中在整个脑部，48 hpf之后，在咽弓和背鳍原基处也检测到明显信号，该结果说明斑马鱼Ammecrl合子表达具有时空特异性，可能参与到脑、咽弓及背鳍的形成与发育过程中。文昌鱼AmphiAmmecrlll原位杂交和实时荧光定量PCR结果同样显示出母源表达特征，但本研究中尚未发现其合子表达，这可能说明4mmecrl是在脊索动物进化过程中获得的新的表达方式(合子表达)，至于合子表达产物是否与母源表达产物行使相同的功能，有待进一步研究。关键词：文昌
7、鱼；斑马鱼；Ammecrl基因；基因表达；进化；胚胎发育2AbtraetPhylogenetic analysis ofAmmecr gene family and itsexDresslon oUrlng amDnl0XUS and ZeDraI-iSII l 一 oembryonic developmentAbtractThe cephalochordate amphioxus is widely regarded as the best available proxyfor protochordate ancestor of the vertebratesIt shares a lot
8、of traits with thevertebrates in both anatomy and embryology,and thus，is widely used as a modelsystem for researches in evolutionary and developmental biology to understand thebasic patterning mechanisms for the chordate body plan and the origin of vertebratesRecent achievements ofthe laboratorial c
9、ulture and genome sequencing ofamphioxushave extensively promoted the pace of amphioxus modelization and also bring thetendency of gene function researches on amphioxusThe contiguous gene deletion syndrome(AMME，Alport syndrome，Mentalretardation，Midface hypoplasia and Elliptoeytosis)is caused by a de
10、letion in Xchromosome，and Ammecrl is one of the genes in this deleted region but whose exactfunction is yet unknownThe identification of Ammecr homologs in severalrepresentative animalsgenome databases displays two Ammecr paralogues，Ammecrland Ammecrli,and a single orthologue in invertebratesTo expl
11、ore the function ofthis gene，we cloned the Ammecrl homologue from amphioxus，and made the analysisof phylogenetic relationship ofAmmecr gene family and detected the gene expressionpatterns during embryonic developments of amphioxus and zebrafishThe eDNA length of AmphiAmmecrlll is 2,920 bp and has an
12、 entire 738 bpcoding region encoding 245 amino acidsThe protein sequence comparison betweenamphioxus and the representatives from vertebrates and invertebrates shows a highsimilarity,especially at the C-terminal regionPhylogenetic analysis base on the full proteinsequence reveals that AmphiAmmeerlll
13、 branching just basal to vertebrate Ammecrl andAmmecrll orthologsThe results hit that the gene of amphioxus could represent the ancestralchordate gene predating the genome duplication events at vertebrate early occurring in the earth3AbtraetHowever,in the present study,we have only found out one Amm
14、ecrl orthoiogue from all availableteleost genome databasesTo verify the result,we amplified potential orthologues of Ammecrlfrom both zebrafish(Danio rerio)and catshark(Chiloscyllium plagiosum)using degeneratedPCR primer,but we obtained entire coding regions of two orthoiogues Ammecrl and Ammecrllfr
15、om the catshark and only single Ammecrl orthoiogue from zebrafishAnd our attempts toamplify the other orthologue in zebrafish did not succeedThe results indicated that theelasmobranches possess two Ammecr genes and the teleosts might have only oneTo further address the origin of AmmecrlAmmecrll orth
16、ologues，we comparedAmphMmmecrllrs exonintron structure with that of Ammecr orthologues in vertebrate andinvertebrateThe result showed that the exonintron organization displayed extensiveconservation through out vertebrates,and the AmphiAmmecrlll only differ thevertebrate orthologues in the last exon
17、 whose size is equal to the sum of the last twoexons of vertebrate Ammecr genesSequence comparison ofthe orthologues suggested that Ammecr family memberscould play similar roles across chordate phylum，therefore，we analyzed Ammecrlexpression across zebrafish and amphioxus to evaluate the possible fun
18、ction of thisgeneComparison of gene expression indicated that both zebrafish andamphioxus orthologs of Ammecrl have maternal expression pattern，whichsuggested a same function they may serve during early embryon ic developmentAnd we found that zebrafish Ammecrl also have zygotic expression pattern，wh
19、ose transcript restricted in the entire brain，arches and pectoral fin buds duringembryonic development，but we can not detected the same expression pattern ofAmphiAmmecrlll during the development of amphioxusThis observationmight imply the vertebrate Ammecrl orthologues brought another role duringemb
20、ryonic development as the evolution of the vertebrate phylum went onKey words：Amphioxus；zebrafish；Ammecrl；gene expression；evolution；embryonicdevelopment4第一章前言文昌鱼简介第一章前言头索动物亚门(Cephalochordata)的动物通常统称为文昌鱼(Amphioxus或Lancelet)。早在前寒武纪地层中即已发现这类动物的化石【，这一古老生物类群的现存种类已不多，但广泛分布于世界各地的温带和热带海洋。虽然经历了5亿多年的漫长历史，这类动物
21、的形态特征却没有发生多大改变，终牛都具有脊索动物门(Chordata)的三大主要特征一一背神经管、脊索和咽鳃裂。在分类学上，文昌鱼与尾索动物亚门(Urochordata)、脊椎动物亚门(Vertebrata)共同构成脊索动物门【2J。 虽然现存文昌鱼不是现代脊椎动物的直接祖先，但它们与生活在约5亿年前脊椎动物的直接祖先非常相似。文昌鱼的形体结构(body plan)和胚胎发生与无脊椎动物(如棘皮动物)有许盆j多相似之处：表皮为单层上皮，其外有角质层：结缔组织不发达：胚胎有纤毛，能在水中游泳；许多器官有分节等。列时，文昌鱼与脊椎动物有更多重要的共同特征：两者都有脊索，都有位于脊索背部的神经管；成
22、体和胚胎均有鳃裂和肌节；胚胎发生时期还有通过胚孔相通的神经管和消化道，即所谓的神经肠管等。这些相似性证明脊椎动物和文昌鱼在早期形态发生过程中有共同的发育机制。文昌鱼不仅在形体结构上与脊椎动物相似，其基因组的组成形式也与之非常类似，只是要简单得多【3J。1 文昌鱼形态结构与生活方式文昌鱼身体细长而侧扁，没有头的分化，前端稍钝，后端较尖，躯体半透明状，有背鳍、腹鳍和尾鳍。其中枢神经系统仅由一根中空的背神经管，其前端略微膨大，形成脑泡，无明显的前脑、中脑和后脑之分，仅是脑的雏形【锚】。它没有骨质的骨骼，只有一条纵贯全身的脊索作为支柱，由于脊索向前越过神经管一直达到身体的最前端，故又称为头索动物。文昌
23、鱼有较复杂的滤食系统和消化系统：在身体前端有一个漏斗形的口笠，其边缘有触须数十条，防止大沙砾进入口中；口笠后面有咽，咽的两侧有垂直的鳃裂，各鳃裂由支持于其中的鳃棒间隔开来，咽鳃区约占消化系统的一半；咽的后部为消化道(肠)，为一直管；消化道向右前方突出膨大，形成中肠盲囊(肝盲囊)，分泌消化液，辅助消化。文昌鱼5第一章前言的鳃裂不直接在体表开孔，而是被皮肤和肌肉包裹，形成一对围鳃腔。围鳃腔和腹鳍的交界处有围鳃腔孔，又称腹孔。在腹孑L后而腹鳍和尾鳍的交界处有肛门(图l-1)。图1-1文昌鱼的解剖示意酣9】注：anus，肛门：atriopore，围鳃腔孔：atrium，围鳃腔；buccal cirri
24、，口笠；cerebralvesicle，脑泡；gonads，性腺：intestine，肠；mouth，口；nerve cord，背神经管；notochord，脊索；pharyngeal gill slits，咽鳃裂；Segmental muscles，肌节。Fig1-1 Dissection of adult amphioxus2文昌鱼的胚胎发育经Conklin等的研究【101，文吕鱼的胚胎发育概况已基本明确。童第周先生等(1961，1964)【11，121在上世纪5060年代进行的一系列研究工作，使我们对文昌鱼胚胎发育的规律又有了进一步的认识。文昌鱼的胚胎发育从受精卵开始，先后经历囊胚、原肠
25、胚、神经胚、幼虫等阶段。文昌鱼的卵子含卵黄很少，营等分全裂式卵裂。随着卵裂的进行，胚胎的中间就形成由单层细胞包围的囊胚腔，发育成囊胚。经原肠作用，文昌鱼胚胎植物极板内陷，最终形成由双层细胞构成的、杯状结构的原肠胚，外面一层为外胚层，里面一。层为中内胚层。当发育到神经胚时期，原肠顶壁两侧外突，逐步形成三胚层，以后分别分化成表皮和神经系统、脊索和肌节以及消化道。3文昌鱼与比较基因组学1970年，Ohno提出如下观点：脊椎动物之所以比无脊椎动物拥有更多的基因是由于其在进化过程中经历了大规模基因复制，基因的倍增会产生更复杂的发6第一章前言育机制，从而产生更为复杂的形体结构。Ohno指出，早期脊椎动物的
26、进化至少发生过两次基因组的倍增131。Holland等(1994，1998)【14，1习在Ohno有关基因倍增假说的基础上做了修改，提出脊椎动物在进化过程中经历了两轮大规模的基因复制，第一轮复制发生在文昌鱼同脊椎动物分离之后，即脊椎动物起源之时；第二轮复制发生在有颌类同无颌类分离之后，这就是所谓的“2R假说”(two roundsofgenome duplication hypothesis)。随后在2003、2007年，Kasahara M、Panopoulou等人又先后对该假说做了进一步的肯定。他们通过总结近几年生物学发展的结果来分析2R假说的可靠性，最后认为该假说无疑是对的Il 6，l
27、71。文昌鱼在进化中处于关键地位，是脊椎动物的姐妹群，与脊椎动物的直接祖先极为相似，在基因大规模倍增前不久，此后约55亿年间进化上极其保守1SJ91。这一类动物即与脊椎动物的祖先分离，因此与现存其他生物比，文昌鱼更能提供脊椎动物早期起源的线索，是研究脊椎动物基因家族进化和动物系统进化的理想外群。4文昌鱼作为模式生物的潜力文昌鱼因其在进化上的特殊地位，近年来已越来越受人们重视，将文昌鱼模式化也成为科研工作者们共同的想法。而文昌鱼自身的特点使其完全具备成为模式生物的潜力，主要表现在：1文昌鱼个体小，养殖花费少，可适应大规模养殖；2文昌鱼身体结构简单，器官少，但具备许多脊椎动物器官的原始形态，是研究
28、进化难得的材料；3文昌鱼繁殖能力强，一条成熟雌鱼一次可排卵10005000个，卵子体外受精，体外发育；4文昌鱼胚胎及成体相对透明，便于直接观察其内部形态结构；5文昌鱼胚胎发育具典型性，发育过程经历囊胚、原肠胚、神经胚及幼虫等阶段。现如今，关于文昌鱼的研究成果大量涌现，同时，文昌鱼实验室繁殖的成功f20】，以及佛罗里达文昌鱼全基因组测序的完成【21，221，这些成果极大地推动了其模式化的进程。7第一章前言二斑马鱼简介上个世纪70年代，美国Oregon大学著名遗传学家Gearge Streisinger首先注意到斑马鱼的优点，从宠物店购买了斑马鱼，开始研究其养殖方法、观察其胚胎发育过程、建立相关的
29、遗传学技术，如体外受精技术、人工诱导雌核发育技术等。1981年，他的研究组建立了纯合品系斑马鱼【23】，随后又报道了第一个自然突变体10lden24。在其后的几年中，Streisinger和他的同事又先后报导了斑马鱼的卵裂特点、胚胎发育规律口5，矧。同时，Streisinger的合作者Charles Kimmel发现斑马鱼另一个对发育生物学极为有利的优点：胚体透明而且发育速度快伫71。这些研究成果的报导，证明了斑马鱼适合用做模式生物，引起了许多发育生物学家的广泛关注。90年代初美国哈佛大学Wolfgang Driever博士的研究组对斑马鱼进行大规模化学诱变研究，到1996年他们共鉴定出约40
30、00种斑马鱼突变体，并发表了第一个斑马鱼基因连锁图，为研究脊椎动物发育的分子机理储备了丰富的遗传资源，成为斑马鱼作为脊椎动物分子发育生物学及人类基因组计划模式动物的标志【2舡321。斑马鱼作为模式生物有以下优点331：1斑马鱼为脊椎动物，有独立的组织器官如脑、感受器、心脏、肝、胰、肾、肠、骨、肌肉等，具备一定代表性；2成鱼个体小，便于大规模养殖；3体外受精、体外发育、胚胎透明，便于显微镜下观察胚胎发育过程；4全基因组测序已完成，斑马鱼基因数据库里有丰富的资料可供查询和下载(http：zfinorgcgi-binwebdriver?Mlval=aa-ZDB homeapg)。斑马鱼发育周期短，根
31、据受精后3 dA内发育过程中的主要形态变化，可以将其早期胚胎发生过程分为7个大的时期：受精卵期(旺三hpf,hours post4fertilization)、卵裂期(兰-2_1 hpf)、囊胚期(2_1-5_1 hpf)、原肠胚期4 4 4 4(5_1 m10 hpf)、分节期(1旺24 hpf)、咽胚期(24_-48 hpf)以及孵化期q(4872 hpf)，然后就进入幼鱼阶段341。8第一章前言N图13斑马鱼早期胚胎发育图134】(A)刚受精的斑马鱼胚胎；(B)单细胞期；(C)两细胞期；(D)64细胞期；(E)256细胞期；(F)3091“包期；(G)5091“包期；(H)7091“包期
32、，侧面观，箭头指示脊索前板； (I)芽期，上箭头所指为Polster，下箭头指示为尾部芽状小膨出：(J)2体节期，箭头所示为新生的体节：(K)15体节期，箭头指示KupfferSvescle： (L)25体节期； (M)24 hpf： (N)42 hpfFig13 Development of the zebrafish embryo at selected stages(A)The zygote within its uplifted chorion；(B)The deehorionated zygote with theanimal pole to the top；(C)Twocell s
33、tage；(D)Sixty-four cell stage；(E)256一cell stage；(F)30-epiboly stage；(G)50-epiboly stage；(H)70-epiboly stage，the arrowshows the prechordal plate；(I)Bud stage，The arrow shows the polster,and thearrowhead shows the tail bud；(J)Twosomite stage；(K)Fifteen-somite stage，Thearrow shows KupfferS vesicle；(L)T
34、wentyfivesomite stage；(M)24 hpf；(N)42 hpf9第一章前言三原位杂交技术原理原位杂交是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，由于探针上参杂有地高辛标记的碱基，利用抗原、抗体特异性识别原理，制各地高辛抗体，并在该抗体上人工接入碱性磷酸酶，由此完成染色系统，使体内表达的RNA的信息转变为肉眼可辨的颜色信息，从而直观的显示内源基因的表达【
35、35l。如图22所示：与目标mRNA互补的带地高辛标记的探针与目标mRNA互补的碱基结合后，经过带碱性磷酸酶的抗地高辛的抗体与地高辛抗原的结合而将碱性磷酸酶引入，以便发生显色反应，使mRNA的表达信息转变为直观的颜色信息【361。与目掾目图22原位杂交原理图36iFig22 Principle of in situ hybridization四 腑c厂基因的研究进展Alport syndrome，mental retardation，midface，and elliptocytosis(AMME)是与x染色体相关的遗传疾病，该疾病患者X染色体发生一段缺失，目前已鉴定出该缺失染色体段包含有COL
36、4A5374们、FACL441训】、dMMECRl和KCNElt4549】4个基因，其中Alport syndrome病症是由C观钰5引起，是以上症状中研究得较透彻的一个，该病症表现为肾功能异常，神经性听力损失，视10第一章前言力异常5仉551，其他病症具体导致原因目前还未知f561。Ammecrl基因是从X染色体上缺失的一段跟AMME疾病相关的序列中鉴定出来的，由Vitelli等人首先报道f5 71。研究发现，人类Ammecrl基因存在三个剪切体，且该基因在细菌、无脊椎动物及脊椎动物中都能找到同源基因，序列相当保守，特别是其中的一段肽段LRGCIG保守性极高。2000年由Viteili等人克
37、隆到老鼠Ammecrl基因mumAmmecrl，研究发现老鼠Ammecrl与人Ammecrl蛋白序列存在952的同源性，所有在人Ammecrl蛋白上预测的功能位点均可在老鼠Ammecrl上找到【5引。Tajika等人于2005年报道了与人4mmecrl基因同源的古细菌Pyrococcus horikoshiiAmmecrl(PH0010)1591，他们构建了该基因的三维蛋白结构图，经研究发现，该蛋白模型包含203个氨基酸和165个水分子，由两个大小不同的蛋白结构域组成，大的结构域由N端和C端共同组成，拥有5个Q螺旋和5个13折叠，小的结构域由4个Q螺旋和三个B折叠组成。此外还发现，高度保守的6
38、个氨基酸残基LRGCIG对于该蛋白的功能有重要作用，而在结构域表面存在一个大的裂缝，里面填充着水分子，且发现该裂缝由保守的氨基酸位点组成，暗示着该裂缝为功能位点，两个蛋白结构域结合并不紧密，推测当有底物结合到该蛋白裂缝时，这两个大小不同的结构域便会大幅移动，从而便于结合该底物。从结合底物的空问大小推测，该底物可能会是较大的物体，例如核酸或蛋白分子，然而，由于裂缝内部并非由带正电氨基酸组成，因而底物不太可能是DNA或RNA等带负电的核酸分子I”J。五 论文的选题和目的Ammecrl基因是一个高度保守的基因，并且分布广泛，在原核生物细菌、真核单细胞生物酵母乃至高等的脊椎动物中都有该基因的踪迹。尤其
39、该基因的3端区域有一段6个氨基酸的区域(LRGCIG)只在文昌鱼中存在一个氨基酸的差异。研究发现该基因在脊椎动物中有两个同源基因，在无脊椎动物中仅存在一个，有意思的是在硬骨鱼中却也只发现一个成员。然而，如此保守的基因家族的功能却并不十分清楚，到目前为止，都没有关于该基因具体功能的报道。研究这一基因在脊椎动物起源与进化过程中经历了怎样的演化过程，比第一章前言较其保守的功能域与基因表达谱之间的对应关系， 有可能为该基因功能及其对有机体发育过程所起的作用提供参考，便于日后揭示该基凶的真面目。文昌鱼是现存与脊椎动物亲缘关系最近的古老物种，然而，在脊椎动物起源过程中的基因组倍增，使得脊椎动物在躯体结构和
40、基因组及基因功能上变得更为复杂。一些与脊椎动物同源的基因在文昌鱼中是否行使与脊椎动物中相同或相似的功能，就难以定论了。鉴于Ammecr基因家族是如此保守，这一基因家族在脊椎动物和其祖先头索动物的发育过程中是否行使同样或相似的功能，应是一值得研究的问题。本论文拟通过构建该基因家族的系统进化树来了解该基因家族的进化关系；用原位杂交技术以及实时荧光定量PCR技术分析该基因在文昌鱼和脊椎动物代表类群斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况，通过比较来推测该基因是否在进化过程中保持了一致的功能抑或在此过程中出现了新的变化。参考文献【l】Chen J V Huang DYLi CWAn early Cambrian
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