1、山东医药2012年第52卷第15期 BDNF基因修饰的NSCs移植对大鼠脊髓损伤后 轴突再生及后肢运动功能的影响 张国庆 。樊立华 ，徐红梅 ，孙奎兴 (1青岛大学医学院附属医院，山东青岛266100；2东营市人民医院； 3青岛大学医学院附属医院海阳分院) 摘要：目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰的神经干细胞(NSCBDNF)移植对脊髓损伤(SCI)的 可行性及效果。方法将120只SCI大鼠随机分为四组各30只，假手术组(Sham组)仅做椎板切开术，伤后3 d损 伤组(SCI组)脊髓内注射生理盐水溶液5 Ixl，NSC组髓内注射移植细胞密度为2 x 10 的NSCs悬液5 Ixl，
2、NSC BDNF组髓内注射NSCBDNF悬液5 l。采用免疫组织化法检测1、3、7、14、28 d脊髓组织BDNF、神经丝蛋白 (NF200)表达；行为学评分法判断后肢运动功能恢复情况。结果NSCBDNF组BDNF水平明显高于其他三组，且 随着时间延长而增高(P005或001)；NSCBDNF组NF200水平、运动功能评分明显高于SCI组、NSC组，低于 Sham组，且随着时间延长而增高和降低(P005或001)。结论NSCBDNF在损伤脊髓内可存活、迁移，并参与 SCI神经轴突的结构重建，从而促进后肢运动功能恢复。 关键词：脊髓损伤；脑源性神经营养因子；神经干细胞；轴突再生；后肢功能 中图分
3、类号：R6512 文献标志码：A 文章编号：1002-266X(2012)15-0048-03 Effects of neural stem cell modified by BDNF transplantation on the axonal regeneration and function of hind limbs in rats after spinal cord iniury ZHANG GuoqingI，PAN Lihua，XU Hong-mei，SUN Kuixing (1 The Affiliated Hospital ofMedical College，Qingdao Un
4、iversity，Qingdao 266100，PRChina) Abstract：0bjective To investigate the effects of neural stem cell(NSC)modified by brain derived neurophic factor (BDNF)transplantation on the axonal regeneration and function of hind limbs in rats after spinal cord injury(SCI)Meth- ods Total of 120 SCI rats were divi
5、ded randomly into 4 groups with 30 in each，the Sham groupreeeived laminotomy only， the 3 d after SCI group was given 5 L normal saline by intraspinal injection，the NSC group was given 5 IxL cell suspen sion of NSC(2 x 105txL)，the NSC-BDNF group was ven 5 L cell suspension of NSCBDNFAfter 1，3，7，14，28
6、 d， the BDNF and NF200 were detected by immunochemistry，hind limb function of the rats was evaluated using BBB open field locomotion rating scoreResults The level of BDNF in NSCBDNF group was significantly higher than that in the other three groups(P005，0O1)in timedependent mannerThe level of NF200
7、in NSCBDNF group was significantly higher than that in the other three groups(P005)，and the BBB score was distinctly higher than that in the SCI and NSC group，was lower than that in Sham group(P005，001)in timedependent mannerConclusion Transplantation of NSCs modified by BDNF can survive in the inju
8、red site of spinal cord，can promote the axonal reconstruction and reeov ery of the function of the hind limb in rats after SCI Key words：spinal cord injury；brain derived neurophic factor；neural stem cell；axonal regeneration；hind limb function 脑源性神经营养因子(BDNF)主要由神经元产 生，对中枢神经系统细胞的分化、发育、生长和存活 等具有重要作用。20
9、05年6月一2009年1月，我们 观察了BDNF基因修饰神经干细胞(NSCBDNF)移 植对脊髓损伤(SCI)大鼠后轴突再生及后肢运动功 基金项目：青岛市科技发展计划资助项目(10-31-71-jch)。 能的影响，旨在为基因修饰神经干细胞移植治疗 SCI的临床应用提供依据。 1材料与方法 11材料成年健康雌性SD大鼠120只，由青岛 大学医学院实验动物中心提供，体质量(250 4-20) g。NF200抗体、BDNF抗体均购于美国Sigma公司， DAB液体、二抗试剂盒均购于Boster公司，其他试 山东医药2012年第52卷第15期 剂均为国产分析纯或化学纯。 12实验方法 121 NSC
10、及NSCBDNF悬液制备含BDNF的 重组腺病毒载体由军事医学科学院的范明教授惠 赠，NSCBDNF悬液制备：移植前2 d取处于对数生 长期的NSC离心后加入无血清培养液，轻柔吹打混 匀成单细胞悬液，计数后调整种植密度为110 ml。按感染复数为200 PFU细胞将含BDNF腺病 毒颗粒储存液加入培养瓶中，放人培养箱中孵育48 h，离心弃上清，用少量无血清培养液重悬成单细胞， 计数后调整细胞浓度为210 ，置于冰上待移 植用。同时制备细胞浓度为210 L的单纯NSC 悬液置于冰上待移植用。 122模型制备及干预将120只SCI大鼠随机 分为四组各30只，假手术组(Sham组)仅做椎板切 开术；
11、另3组采用自行研制的电控SCI打击装置制 作SCI模型，铁棒重10 g，下落25 cm，棒下端直径 25 mm，与硬脊膜接触时间为01 S。制模后3 d动 物重新麻醉后参照Miura等 的方法，采用脊髓内 微量注射法进行基因转移及基因工程化神经干细胞 移植。脊髓损伤组(SCI组)脊髓内微量注射生理盐 水溶液5 ，NSC组髓内注射移植细胞密度为2 X 10 L的NSCs悬液5 L，BDNF基因修饰神经干 Lo 123 BDNF、神经丝蛋白(NF200)水平检测移 植后第1、3、7、14、28天将大鼠深度麻醉，以04 多聚甲醛行心脏灌流固定，分别取损伤段脊髓，在 30蔗糖磷酸盐缓冲液中沉底后，用冰
12、冻切片机作 连续横切片，片厚3O m，按二步法免疫组化试剂盒 操作步骤检测BDNF、NF200水平，采用LEICA QWIN图像处理与分析系统进行图像分析。 124后肢运动功能评定于移植后1、3、7、l4、 28 d采用BBB评分法 评定后肢运动功能(正常 21分)。由2名研究者分别观察同一只大鼠两侧后 肢，取均值记录。所有观察均在晚上8点进行。 13统计学方法采用SPSS100统计软件，数据 以 s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采 用完全随机设计方差分析法进行统计学分析。检验 水准仅=005。 2 结果 21 BDNF、NF200表达 见表1。由表1可见， NSCBDNF组BDNF、
13、NF200水平明显高于其他三 组，且随着时间延长而增高，BDNF峰值时间为14 d，NF200为28 d。 22运动功能评分见表2。由表2可见，NSC BDNF组运动功能评分明显高于SCI组、NSC组，低 细胞组(NSCBDNF组)髓内注射NSCBDNF悬液5 于Sham组，且随着时间延长升高。 表1各组不同时点BDNF、NF200表达水平比较(i ) 组别 1 d 3 d 7 d 14 d 28 d 注：与其余3组比较， P005， P001；与NSC组比较， P005， P0O1；与Sham组比较， P005， P0O1 表2各组不同时点运动功能评分比较(分， ) 组别 BDNFNSC组
14、SCI组 NSC组 Sham组 20O6 16O2 17O5 21O士0O 4208 23士06 31土09 210OO 9117 3108 7612 21O士OO 11819 36士O7 9214 210士O0 14009 43O4 10712 21O士O0 注：与SCI组比较， P005；与其余三组比较， P001 3讨论 活、轴突不能再生的原因之一，保存残留轴突并促进 SCI后损伤区神经元和胶质细胞大量死亡，神 这些轴突修复和再生是SCI研究和治疗中最为重要 经营养因子明显减少是SCI后残存神经元不能存 的内容 。 49 NF200是神经元胞体和神经轴突细胞骨架的主 要成分，在维护神经元
15、的功能和轴浆转运等一系列 与SCI修复相关的病理生理变化中发挥着重要作 用 ，SCI后轴突变形、坏死后NF200表达量减少， 脊髓细胞修复时NF200合成增多，故NF200水平可 反映SCI后轴突损伤和修复程度。 BDNF是一种重要的感觉和运动神经元营养因 子。研究证实，BDNF可支持神经脊及基板衍生的 感觉神经元轴突的生长，保护和减少运动神经元死 亡，维持胚胎、新生大鼠和成年大鼠的运动神经元存 活，还具有刺激、诱导轴突再生的功能；中胸段脊髓 挫伤后连续4周进行高浓度的BDNF鞘内注射，能 够促进SCI中心的胆碱乙酰化酶阳性运动轴突的再 生；神经轴突能够向着神经生长因子浓度高的区域 迁移生长，
16、而通过转基因技术采用髓内注射的方法 可以获得外源基因载体的长期高效的表达 。 SCI的治疗主要围绕提供受损轴突生长微环 境，增强轴突受损神经细胞再生两大方面 J。神经 干细胞不仅可以提供神经元，促进神经环路的重建， 而且可用来转基因从而提供一个促进神经元轴突再 生的微环境。基因修饰神经干细胞参与神经再生的 机制可能有以下方面：促进受伤神经元轴突的再 生延长，中枢神经系统神经元轴突并非不能再生，只 是缺乏促进再生的环境，而基因修饰的神经干细胞 可能通过分化成成熟的细胞，不断分泌生长因子，从 而形成一个利于细胞再生的细胞外环境；促进受 伤神经元轴突的再髓鞘化；神经干细胞可以分化成 少突胶质细胞，这
17、些细胞可能参与形成新的髓鞘，从 而促进神经环路的重建，此为神经再生的重要环节。 本研究显示，NSCBDNF组BDNF水平明显高 告读者 山东医药2012年第52卷第15期 于其他三组，且随着移植时间延长而增高；NSCBD NF组NF200水平、运动功能评分明显高于SCI组、 NSC组，且随着时间延长而增高，提示NSC-BDNF 治疗SCI效果确切，其主要作用是促进轴突再生并 可为轴突的再生提供适合的微环境，是治疗SCI的 一个重要途径。 总之，NSCBDNF在损伤脊髓内可存活、迁移并 参与SCI大鼠神经轴突的结构重建，从而促进大鼠 后肢运动功能恢复。 参考文献： 1Miura T，Tanaka
18、 S，Sheikh A，et a1Partial functional recovery of paraplegic rat by adenovirusmediated gene delivery of constitutively active MEK1JExp Neurol，2000，166(1)：115126 2Basso DM，Beattie MS，Brenham jcA sensitive and reliable loco motors rating scale for open field testing in ratsJJ Neurotrauma， 1995，12(1)：1-2
19、1 3Zamia EA，Cain LD，Everhart AW，et a1Transplant therapy：Re covery of function after spinal cord injuryJJ Neurons trauma， 1997，14(8)：479506 4Uchida K，Baba H，Maezawa Y，et a1Progressive changes in neu rotilament proteins and growth-associated protein-43 immunochemis- try at the site of cervical spinal
20、cord compression in spinal hyperosto sis miceJSpinal，2002，27(5)：480 5Jake man LB，Wei P，Guan Z，et a1Brain derived neurotrophic factor stimulates hind limb stepping and sprouting of cholinergic fi bers after spinal cord injuryJExp Neurol，1998，154(1)：170 184 6Leonard J，Martin 0，Mary BB，et a1Neurotrophi
21、c factors，cellular bridges and gene therapy for spinal cord injuryJJ Physiol， 2001，533(1)：83-89 7Mckerrcher LSpinal cord repair：strategies to promote axon regen erationJNeurobiols，2001，8(1)：1118 (收稿日期：2011-09-04) 关于医学名词与统计学符号的应用说明 医学名词要以1989年及以后由全国自然科学名词审定委员会审定、公布，科学出版社出版的医学名 词和相关科学的名词为准，暂未公布者仍以人民卫生出版社出版的英汉医学词汇为准。中文药物名称 应使用1995年药典(法定药物)或卫生部药典委员会编辑的药名词汇(非法定药物)中的名称，英文药物 名称则采用国际非专利药名，不用商品名。 按GB3358-82统计学名词及符号的有关规定书写，常用统计学符号的书写如下：样本的算术平均数 用英文小写 (中位数仍用 )；标准差用英文小写S；检验用英文小写t；F检验用英文大写F；卡 方检验用希文小写 ；相关系数用英文小写r；自由度用希文小写 ；概率用英文大写P。以上符号均 用斜体。 50
