1、布鲁氏菌病诊断技术规程(NYSY161-2000 )1范围本规程规定了布鲁氏菌病虎红平板凝集试验、试管凝集试验、全乳环状反应试验和补体结合试验，适用于布鲁氏菌病的检疫。2虎红平板凝集试验2.1 试剂布鲁氏菌病虎红平板凝集抗原，标准阳性、阴性血清，由中国兽药监察所生产。2.2 操作方法2.2.1 备一块洁净玻璃板，画成若干个 4cm2 小格。或直接使用虎红平板凝集试验卡片。2.2.2 取被检血清和抗原（抗原使用前应充分摇匀）各一滴（约 301）等量混合，充分摇匀，在 4 分钟内读取结果，同时作阴、阳性对照。2.2.3 被检血清在规定时间内出现凝集反应者判为阳性，不出现凝集者为阴性。2.2.4 本
2、试验出现阳性反应的动物，需经补体结合试验或其他辅助试验方可定性。3试管凝集试验3.1 试剂3.1.1 抗原，阳性血清、阴性血清，由中国兽药监察所生产。3.1.2 试验用稀释液：石炭酸生理盐水，用化学纯石炭酸 5g 和化学氯化钠 8.5g 加至1000 毫升蒸馏水中制成，经高压灭菌后备用。3.2 操作方法被检血清必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和腐败气味。3.2.1 被检血清的稀释：一般情况，牛、马和骆驼用 1：50，1：100，1：200 和1：400 四个稀释度；猪、山羊、绵羊和狗用 1：25，1：50，1：100，1：200 四个稀释度。大规模检疫时也可用两个稀释度即牛、马和骆驼为 1
3、：50 和 1：100；猪、山羊、绵羊和狗1：25 和 1：50。3.2.2 血清稀释（以羊、猪为例）和加人抗原的方法每份血清用 5 支小试管（口径 810 毫米） ，第一管加人 2.3m1 石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、第四和第五管各加入 0.5ml。用 l ml 吸管吸取被检血清 0.2m1，加人第一管中，并混合均匀。混匀后，以该吸管吸取混合液分别加人第二管和第三管，每管 0.5ml。以该吸管将第三管的混合液混匀吸取 0.5ml 加人第四管混匀后，又从第四管吸出 0.5 ml 加人第五管，第五管混匀完毕弃 0.5ml。如此稀释之后从第二管起血清稀释度分别为1：12.5、1：25、1：5
4、0 和 1：1000 血清规定用 0.5石炭酸生理盐水稀释，但检验羊血清时用 0.5石炭酸 10%盐水溶液稀释。加人抗原的方法：先以 0.5石炭酸生理盐水将抗原原液作 20 倍稀释（如果血清用0.5石炭酸 10盐水溶液稀释则抗原原液亦用 0.5石炭酸 10盐水稀释） ，然后加人上述各管（第一管不加，留作血清蛋白凝集对照） ，每管 0.5ml，振摇均匀，加人抗原后，第二管至第五管各管混合液的容积均为 1 ml，血清稀释度从第二管起依次变为：1：25，1：50， 1 ：100 和 1：200。牛、马和骆驼血清稀释和加抗原法：具体方法与上述一致，不同的是，第一管加2.4m10.5石炭酸生理盐水和 0
5、.1m1 被检血清，加抗原后从第二管到第五管血清稀释度为1：50，1：100，1：200 和 1：400。3.2.3 对照管的制作每次试验须作三种对照各一份。阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与被检血清同。阳性血清对照：阳性血清对照须稀释到其原有滴度，加抗原的方法与被检血清相同。抗原对照（了解抗原是否有自凝现象）：加 1：20 抗原稀释液 0.5m1 于试管中，再加0.5m10.5石炭酸生理盐水（如果血清一用 0.5%石炭酸 10盐水溶液稀释则也加人 0.5石炭酸 10%盐水溶液） 。3.2.4 比浊管的制作每次试验须配制比浊管作为判定清亮程度（凝集反应程度）的依据，配制方法如下：取本
6、次试验用的抗原稀释液（即抗原原液的 20 倍稀释液）5l0ml 加人等量的 0.5石炭酸生理盐水（如果血清用 0.5石炭酸 10%盐水稀释，则加人 0.5石炭酸 10盐水溶液）作对倍稀释，然后按下表配制比浊管。表 131管号 抗原稀释液（ml） 石炭酸生理盐水 （ml） 清亮度 标记1 0.0 1.0 100 2 0.25 0.75 75 3 0.50 0.50 50 4 0.75 0.25 25 5 1.0 0.0 0 3.2.5 全部试管于充分振荡后置于 3738恒温箱中 2224 小时，然后检查并记录结果。3.2.6 记录结果根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应的强度（凝集价） ，特别
7、是 50清亮度（即“”的凝集）对判定结果关系很大，需用比浊管对照判定。：完全凝集和沉淀，上层液体 100清亮（即 100菌体下沉） 。：几乎完全凝集和沉淀，上层液体 75清亮。十：沉淀明显，液体 50清亮。：无沉淀，液体 25清亮。确定每份血清的效价时，应以出现“”以上的凝集现象（即 50的清亮）的最高血清稀释度为血清的凝集价。3.3 结果判定3.3.1 牛、马和骆驼于 1：100 稀释度，猪、山羊、绵羊和狗于 1：50 稀释度出现“”以上的凝集现象时，被检血清判定为阳性反应。牛、马和骆驼于 1：50 稀释度，猪、山羊、绵羊和狗于 1：25 稀释度出现“十”以上凝集现象，被检血清判定为可疑反应
8、。3.3.2 可疑反应的牲畜，经 34 周，须重新采血检验。在牛和羊，如果重检时仍为可疑，该畜判定为阳性；在猪和马重检时，如果凝集价仍然保持可疑反应水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性反应的患畜出现，该血清判定为阴性。3.3.3 鉴于猪血清常有个别出现非特异性凝集反应，在试验时须结合流行病学判定结果。如果被检血清中有个别出现阳性反应（例如凝集价为 1：1001：200)，但猪群中所有的猪只均无布氏杆菌临床症状（流产、关节炎、肇丸炎等） ，可考虑此种反应为非特异性，经34 周可采血重检。4全乳环状反应试验4.1 试剂吐布鲁氏菌病全乳环状反应抗原，标准阳性、阴性血清，由中国兽药监察所生产。42
9、 操作万法取牛新鲜全乳 l ml 于小试管内，加人本抗原 1 滴（约 501) ，充分混合，置 37温箱中作用 1 小时，取出读取结果。43 结果判足十：强阳性反应：乳柱上层乳脂形成明显红色环带，乳柱白色，临界分明。十：阳性反应：乳脂层呈红色，但不显著，乳柱略带颜色。：弱阳性反应：乳脂层环带颜色，乳柱小褪色。士：疑似反应：乳脂层环带颜色不明显。5补体结合试验5.1 试验材料5.1.1 37水浴箱，普通离心机，普通冰箱，吸管，凝集试验管，试管架等。5.1.2 稀释液：生理盐水。5.1.3 溶血素：由兽医生物药品厂生产提供。5.1.4 补体：选择健康豚鼠 35 只，于使用前一天早晨饲喂前或停食后
10、6 小时从心脏采血，分离血清后混合保存于普通冰箱中，也可从兽医生物药品厂购买冻干补体，使用前加稀释液恢复原量后使用。表 132 各种被检动物血清的灭能温度和时间血清类别 灭能温度（） 灭能时间（分钟）羊 5859 30马 5859 30驴、骡 6364 30黄牛、水牛、猪 5657 30骆驼 54 305.1.5 绵羊红细胞悬液：采取成年公绵羊血，按常规方法脱纤、洗涤、离心，用稀释液洗涤 34 次，最后一次以 2000r/min 离心沉淀 10 分钟，取下沉的红细胞，以稀释液配制成 2.5红细胞悬液。5.1.6 阴、阳性血清对照：由兽医生物药品厂提供。5.1.7 抗原：由中国兽药监察所生产。5
11、.1.8 被检血清以常规方法采血和分离血清，用稀释液将血清作 1：10 稀释，按表 13-2 规定在水浴箱中灭能。52 预备试验正式试验前，将试验的各种成分进行测定。5.2.1 溶血素效价测定5.2.11 稀释溶血素取 0. 2m1 含等量甘油防腐的溶血素，加 9.8ml 稀释液配成 1：100 的基础稀释液，按表 13-3 方法作进一步稀释。5.2.1.2 按表 13-4 加入各成分，而后 3738水浴 20 分钟。表 13-3 溶血素稀释法 单位： ml管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111： 100溶血素 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0
12、.1 0.1 0.1稀释液 0.8 0.9 1.4 1.9 2.4 2.9 3.4 3.9 4.4 4.9 5.4溶血素稀释倍数 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 55005.2.1.3 溶血素效价从水浴中取出，立即判定结果，用 1：20 补体 0.5m1 在 3738水浴 20 分钟，能使2.5红细胞液 0.5m1 完全溶血的最小睡量溶血素为溶血素效价或称一单位溶血素。表 13-4为例，对照管均不溶血，16 管完全溶血，测定溶血素效价为 3000 倍。正式试验时溶血素的工作效价为滴度效价的倍量或称二单位溶血素，表 13-4 为例
13、，工作效价为 1500 倍。价测定后，23 个月内可按此效价使用，不必重测。5.2.2 补体效价测定每次补体结合试验，应于当日测定补体的效价。5.2.2.1 稀释补体并加各种成分用稀释液配制 1：20 稀释补体，按表 13-5 加人各种成分后，前后经 3738水浴 20分钟 2 次。表 134 溶血素效价测定表 单位：ml对照管管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11溶血素 补体 稀释液稀释倍数 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 45000 5000 5500 100溶血素 加入量 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
14、0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0稀释液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 2.01：20 补体 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.5 02.5红细胞 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.53738水浴 20 分钟 结果（例） 全部溶血 部分溶血 全部不溶血5.2.2.2 补体效价经过 2 次水浴，在 2 单位溶血素存在的情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原
15、及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需要最小补体量，就是所测得的补体效价。表 13-4 为例，第 6 管 1：20 稀释的补体 0.25m1，即为一个补体单位。5.2.2.3 原补体在使用时应稀释倍数的计算原补体应稀释倍数（补体稀释倍数/测得效价）使用时每管加入量。表 13-5 为例，按公式计算（ 20/0.25) 0 . 5 = 40 倍。即此例补体应作 40 倍稀释，每管加 0.5ml，即为一个补体单位。考虑补体性质不稳定，操作过程中效价会降低，正式试验时使用浓度比补体效价要大 10左右，本例补体工作单位应作 1：36 稀释，每管使用 0.5m1。5.2.3 抗原效价测定一般按照兽医
16、生物制品厂产品说明书的效价使用。在初次使用或过久等原因需要测定时，按下述步骤进行。5.2.3.1 须取用二份阳性血清（分别为强阳性和弱阳性血清）和一份阴性血清来测定抗原效价。5.2.3.2 阴性血清和阳性血清稀释用稀释液对阴性对照血清作 1:10 稀释，阳性对照血清稀释成1：10，1：25，1：50，1：75 和 1：100 等 5 个稀释度。5.2.3.3 稀释抗原用稀释液将抗原稀释成1：10，1：50，1：75，1：100，1：150，1：200，1：300，1：400 和 1：500 等稀释度。5.2.3.4 按表 13-6 加人各种成分并经 3738水浴 20 分钟 2 次。5.2.3
17、.5 记录抗原测定结果从水浴中取出反应管，观察溶血百分数，记录结果。 （溶血程度的标准比色管配制见5.3.4)例举范例如表 13-7。表 135 补体效价测定 单位：ml对照管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 131：20 补体加入量 0.10 0.13 0.16 0.19 0.22 0.25 0.28 0.31 0.34 0.37 0.5 0 0稀释液加入量 0.40 0.37 0.34 0.31 0.28 0.25 0.22 0.19 0.16 0.13 1.5 1.5 2.0工作量抗原加入量（不加抗原管加稀释液） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.
18、5 0.5 0.5 0.5 0 0 010 倍稀释阳（阴）性血清 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0 0振荡均匀后，3738水浴 20 分钟二单位溶血素 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.5 02.5红细胞悬液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5振荡均匀后，3738水浴 20 分钟阳性血清加抗原 阳性血清不加抗原 阴性血清加抗原 结果（例）阴性血清不加抗原 在正式试验时，抗原的稀释度应比测定的效价浓 25，表 137 为例
19、，其效价为1：150，正式试验时按 1：112.5 稀释使用。表 136 布鲁氏菌补体结合抗原效价测定 单位：ml对照管号 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11稀释倍数 10 50 75 100 150 200 300 400 500补体对照溶血素对照抗原加入 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0量各种血清稀释度加入量 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0工作量补体 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 03738水浴 20 分钟二单位溶血素 0.5 0.5
20、 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.52.5红细胞 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.53738水浴 20 分钟5.2.3.6 抗原效价抗原对阴性血清完全溶血。对两份阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价。5.3 正式试验5.3.1 根据预备试验测定的效价稀释配制各成分的工作液按表 138 程序进行正式试验，每次试验设一组对照。表 137 布鲁氏菌补体结合抗原效价滴定结果（举例）稀释倍数 10 50 75 100 150 200 300 400 50010 100 0 0 0 0 0 0 0
21、 025 100 0 0 0 0 0 0 0 050 100 10 0 0 0 0 0 10 2075 100 50 20 0 0 0 20 30 80血清稀释倍数100 100 80 50 20 10 20 80 80 1005.3.2 各试验管经 3738水浴 20 分钟 2 次，加温完毕后取出立即进行第一次判定。要求不加抗原的阳性血清对照管、不加或加抗原的阴性血清对照管、抗原对照管呈完全溶血反应。5.3.3 初步判定后静置 12 小时作第 2 次判定，第 2 次判定时要求溶血素对照管、补体对照管呈完全抑制溶血。对照正确无误即可对被检血清进行判定，被检血清加抗原管的判定参照标准比色管（见
22、5.3.4)记录结果。5.3.4 溶血程度的标准比色管的配制配制方法如表 13-9，牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。表 138 布鲁氏菌补体结合试验的正式试验 单位：ml对照管血清 被检血清阳性血清 阴性血清 抗原 溶血素 补体血清加入量 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0 0稀释液 0 0.5 0 0.5 0 0.5 0 1.5 1.5抗原 0.5 0 0.5 0 0.5 0 1.0 0 0工作量补体 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.53738水浴 20 分钟二单位溶血素 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
23、 02.5红细胞 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.53738水浴 20 分钟判定结果举例 + + + +表 139 标准比色管的配制方法及反应判定标准溶血程度（） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100溶血溶液 0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.502.5红细胞溶液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0稀释液 2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0判定符号 + + + + + + + + + + 判定标准 阳性 可疑 阴性
