1、一，名词解释1.（ Northern blot） Northern 印 迹 杂 交 。 这 是 一 种 将 RNA 从 琼 脂 糖 凝 胶 中 转 印 到 硝 酸 纤 维 素 膜 上 的 方 法 。Northern 印 迹 杂 交 的 RNA 吸 印 与 Southern 印 迹 杂 交 的 DNA 吸 印 方 法 类 似 ， RNA 印 迹 技 术 正 好 与 DNA 相 对 应 ，故 被 称 为 Northern 印 迹 杂 交 。（ Southern blot） Southern 印 迹 杂 交 是 一 种 常 用 的 DNA 定 量 的 分 子 生 物 学 方 法 。 一 般 利 用
2、琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分离 经 限 制 性 内 切 酶 消 化 的 DNA 片 段 ， 将 胶 上 的 DNA 变 性 并 在 原 位 将 单 链 DNA 片 段 转 移 至 尼 龙 膜 或 其 他 固 相 支 持物 上 ， 经 干 烤 或 者 紫 外 线 照 射 固 定 ， 再 与 相 对 应 结 构 的 标 记 探 针 进 行 杂 交 ， 用 放 射 自 显 影 或 酶 反 应 显 色 ， 从 而 检 测特 定 DNA 分 子 的 含 量 。2.（ cis-acting element） 顺式作用元件。存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编
3、码任何蛋白质, 仅仅提供一个作用位点, 要与反式作用因子相互作用而起作用。(trans-acting factor)反 式 作 用 因 子 。 是 指 能 直 接 或 间 接 地 识 别 或 结 合 在 各 类 顺 式 作 用 元 件 核 心 序 列 上 参 与 调 控 靶基 因 转 录 效 率 的 蛋 白 质 。3.(VNTR )可 变 数 目 串 联 重 复 多 态 性 。 可 变 数 目 串 联 重 复 序 列 是 重 复 单 位 为 924bp， 重 复 次 数 变 化 大 ， 呈 高 度 多 态性 的 DNA 序 列 ， 又 称 小 卫 星 DNA， 拷 贝 数 101000 不 等
4、 。（ STR） 短 串 联 重 复 序 列 。 又 称 微 卫 星 DNA， 是 一 类 简 单 的 寡 核 苷 酸 串 联 重 复 序 列 ， 其 重 复 单 位 为 26bp， 重复 次 数 1060 次 左 右 ， 其 长 度 通 常 小 于 150bp， 分 布 在 所 有 染 色 体 中 。4.（ viral oncogene） 病毒癌基因。病毒（ 大 多 是 逆 转 录 病 毒 ） 具有的一种可以使宿主细胞发生癌变的基因。源自细胞中的正常基因。(cell-oncogene)细 胞 癌 基 因 。 存 在 于 正 常 的 细 胞 基 因 组 中 ， 与 病 毒 癌 基 因 有 同
5、源 序 列 ， 具 有 促 进 正 常 细 胞 生 长 、增 殖 、 分 化 和 发 育 等 生 理 功 能 。 在 正 常 细 胞 内 未 激 活 的 细 胞 癌 基 因 叫 原 癌 基 因 ， 当 其 受 到 某 些 条 件 激 活 时 ， 结 构 和 表达 发 生 异 常 ， 能 使 细 胞 发 生 恶 性 转 化 。5.(ORF) 开 放 阅 读 框 。 在 mRNA 的 核 苷 酸 序 列 中 ， 有 一 段 序 列 是 一 个 特 定 蛋 白 质 多 肽 链 的 序 列 信 息 ， 这 一 段 核 苷 酸 序列 从 起 始 密 码 子 开 始 ， 到 终 止 密 码 子 结 束 。
6、（ UTR） 非 翻 译 区 。 是 mRNA 分 子 两 端 的 非 编 码 片 段 。6.（ enhancer） 增强子。存在于基因组中的对基因表达有调控作用的 DNA 调控元件。位置不定，结合转录因子后，可增强基因表达。（ silencer） 沉默子。可降低基因启动子转录活性的一段 DNA 顺式元件。与增强子作用相反。7.（ microsatellite DNA） 微卫星 DNA。是 一 类 简 单 的 寡 核 苷 酸 串 联 重 复 序 列 ， 其 重 复 单 位 为 26bp， 重 复 次 数1060 次 左 右 ， 其 长 度 通 常 小 于 150bp， 分 布 在 所 有 染
7、色 体 中 。(Minisatellite DNA) 小 卫 星 DNA。 可 变 数 目 串 联 重 复 序 列 是 重 复 单 位 为 924bp， 重 复 次 数 变 化 大 ， 呈 高 度 多态 性 的 DNA 序 列 ， 拷 贝 数 101000 不 等 。8.（ RFLP） 限制性片段长度多态性。是 指 基 因 型 之 间 限 制 性 片 段 长 度 的 差 异 ， 这 种 差 异 是 由 限 制 性 酶 切 位 点 上 碱 基 的插 入 、 缺 失 、 重 排 或 点 突 变 所 引 起 的 。 用于分析相关基因多态性的技术。即用同一种限制性内切酶，完全酶切来源于同一物种不同个体
8、的基因组 DNA，从而获得长度各异的 DNA 片段( 酶切谱) 。（ SNP） 单核苷酸多态性。不同物种、个体基因组 DNA 序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。有这种差别的基因座、DNA 序列等可作为基因组作图的标志。人基因组上平均约每 1000 个核苷酸即可能出现 1 个单核苷酸多态性的变化，其中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关，但可能大多数与疾病无关。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。9.(cloning vector)克隆载体。可携带插入的外源 DNA 片段并可转入受体细胞中大量扩增的 DNA 分子。该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，
9、常用于外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。（ expression vector） 表达载体。能使插入基因进入宿主细胞表达的克隆载体，包括原核表达载体和真核表达载体，可以是质粒、噬菌体或病毒等。典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列，并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切酶位点。10.（ optional exon） 外显子选择。是指在不同的剪接方式中，某一个外显子（或几个外显子）可以在成熟的 mRNA 中保留，也可以通过剪接过程被去掉。所以，至少有两种剪接方式，一是外显子全部保留，二是删除一个或几个外显子。（ optional intron） 内含子选择。是指在不同的剪接方式中，内含子可以被
10、完全去掉，也可以有一个内含子被保留在成熟的 mRNA 中。有两种剪接方式，一是内含子全部删除，二是保留某一个内含子。11.（ promoter） 启动子。DNA 分子上能与 RNA 聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域。在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。（ terminator） 终止子。转录过程中能够终止 RNA 聚合酶转录的 DNA 序列。使 RNA 合成终止。 。转录过程产生RNA 的一段可终止转录的茎-环结构序列； 位于模板基因下游该结构所对应的 DNA 序列。在大肠杆菌中有依赖于 或不依赖于 的两类终止子。12.（ leader sequence） 前导序列。mR
11、NA 5端的核苷酸片段。位于翻译起始密码子 AUG 之前。在真核生物中前导序列通常是不翻译的；在原核生物中，前导序列含有的 SD 序列可与核糖体小亚基的 16S rRNA 相配对，置起始密码子于核糖体上适当位置，以启动翻译过程。（ SD sequence） SD 序列。信使核糖核酸(mRNA)翻译起点上游与原核 16S 核糖体 RNA 或真核 18S rRNA 3端富含嘧啶的 7 核苷酸序列互补的富含嘌呤的 37 个核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖体小亚基与 mRNA 结合并形成正确的前起始复合体的一段序列。13.（ gene） 基因。编码蛋白质或 RNA 等具有特定功能产物的遗传信息的基本
12、单位，是染色体或基因组的一段 DNA 序列(对以 RNA 作为遗传信息载体的 RNA 病毒而言则是 RNA 序列)。包括编码序列(外显子) 、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子) 。（ pseudogene） 假基因。基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的 DNA 序列。分为两大类：一类保留了相应功能基因的间隔序列，另一类缺少间隔序列，称为加工过的假基因或返座假基因。14.（ operon） 操纵子。转录的功能单位。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个 DNA 序列。主要见于原核生物
13、的转录调控，如乳糖操纵子、色氨酸操纵子等。（ operator） 操纵基因。与一个或者一组结构基因相邻近，并且能够与一些特异的阻遏蛋白相互作用，从而控制邻近的结构基因表达的基因。15.（ gene rearrangement） 基因重排。基因的可变区通过基因的转座、DNA 的断裂错接而使正常基因顺序发生改变的现象。尤指在 B 细胞分化过程中抗体基因的重排及 T 细胞抗原受体基因的重排，是基因差别表达的一种调控方式。（ gene replacement） 基因置换。通过基因操作等用一个基因替换另一个基因的过程。如用正常基因替换有缺陷的基因，使基因的功能得以恢复。16.（ receptor） 受体
14、。能与细胞外专一信号分子（配体）结合引起细胞反应的蛋白质。分为细胞表面受体和细胞内受体。受体与配体结合即发生分子构象变化，从而引起细胞反应，如介导细胞间信号转导、细胞间黏合、细胞胞吞等细胞过程。（ Adaptor） 衔 接 子 。 是 一 小 段 带 有 一 个 平 端 （ 与 双 链 cDNA 连 接 ） 和 一 个 粘 性 端 末 （ 可 与 载 体 的 相 应 末 端 连 接 ）的 双 链 核 苷 酸 。 它 与 双 链 cDNA 连 接 后 无 需 进 行 限 制 酶 消 化 。 就 可 以 与 载 体 相 连 接 。17.（ initiator caspase） 起 始 者 胱 天
15、蛋 白 酶 。 位 于 胱 天 蛋 白 酶 级 联 活 化 途 径 上 游 ， 如 caspase8， 9 和 10， 有 较长 的 源 域 ， 其 中 有 和 接 头 蛋 白 或 构 架 蛋 白 相 互 作 用 的 功 能 域 ， 它 们 通 过 蛋 白 相 互 作 用 自 我 激 活 ， 在 FADD 的 介 导下 从 细 胞 浆 中 被 募 集 到 细 胞 膜 ， 前 体 聚 集 在 一 起 提 高 了 它 们 内 在 的 酶 活 性 而 自 我 激 活 。（ effector caspase） 效 应 者 胱 天 蛋 白 酶 。 如 caspase3， 6 和 7， 它 们 有 较 短
16、 的 原 域 ， 位 于 胱 天 蛋 白 酶 级 联 下 游 ，前 体 能 被 起 始 者 胱 天 蛋 白 酶 切 割 而 活 化 。 活 化 的 效 应 者 胱 天 蛋 白 酶 能 切 割 底 物 ， 使 细 胞 凋 亡 。18.（ transfection） 转 染 。 起初指外源基因通过病毒或噬菌体感染细胞或个体的过程。现在常泛指外源 DNA（包括裸DNA）进入细胞或个体导致遗传改变的过程。（ transformation） 转 化 。 是 某 一 基 因 型 的 细 胞 从 周 围 介 质 中 吸 收 来 自 另 一 基 因 型 的 细 胞 的 DNA 而 使 它 的 基 因型 和 表
17、 型 发 生 相 应 变 化 的 现 象 。 这 现 象 首 先 发 现 于 细 菌 ， 也 是 细 菌 间 遗 传 物 质 转 移 的 多 种 形 式 中 最 早 发 现 的 一 种 。19.（ gene family） 基 因 家 族 。 基因组中存在的许多来源于同一个祖先，结构和功能相似的一组基因。同一家族的这些基因的外显子具有相关性，可在基因组内集中或分散分布。（ gene superfamily） 基因超家族。结构上有一定的相似性，但是功能不一定相同。这些基因在进化上亲缘关系较远，最经典的是免疫球蛋白基因超家族。20.（ homomultimer） 同源多聚体。多 聚 体 是 由 单
18、 体 结 合 而 成 的 分 子 。 生 物 分 子 （ 如 蛋 白 质 、 碳 水 化 合 物 、 核 酸 ）都 是 多 聚 体 。 例 如 同源多聚体蛋 白 质 是 由相同亚基组成的蛋白质。（ heteromultimer） 异源多聚体。 有不同的亚基(不同基因编码)组成的蛋白质。二，重点1.基因：基因是负责编码 RNA 或一条多肽链的 DNA 片段，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列及插入序列。2.原核生物基因组较小，其结构比较简单，重复序列少，结构基因在基因组中所占的比例较大（约 50%），其基因组通常仅由一条双链环状 DNA 分子组成。操纵子结构是原核生物基因组的结构特点之一，在非编
19、码区内主要是一些调控序列。细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象，即转座子。质粒 DNA 是独立于细菌染色体 DNA 的、具有自主复制能力的双链环状DNA，质粒在细菌内的存在会赋予宿主细胞一些新的遗传性状。真核生物基因组一般比较庞大，但是结构基因在基因组中所占比例比较小，存在着大量的重复序列。人的基因组中，只有 2%3%的 DNA 序列是编码序列。 （见 P23）3.DNA 复 制 过 程 ： 引 发 ， 延 伸 ， 终 止 。（ 1） 引 发 ： 复 制 的 引 发 (Priming)阶 段 包 括 DNA 复 制 起 点 双 链 解 开 ， 通 过 转 录 激 活 步 骤 合 成 RNA
20、分 子 ， RNA 引物 的 合 成 ， DNA 聚 合 酶 将 第 一 个 脱 氧 核 苷 酸 加 到 引 物 RNA 的 3-OH 末 端 复 制 引 发 的 关 键 步 骤 就 是 前 导 链 DNA的 合 成 ， 一 旦 前 导 链 DNA 的 聚 合 作 用 开 始 ， 滞 后 链 上 的 DNA 合 成 也 随 着 开 始 ， 在 所 有 前 导 链 开 始 聚 合 之 前 有 一 必需 的 步 骤 就 是 由 RNA 聚 合 酶 (不 是 引 物 酶 )沿 滞 后 链 模 板 转 录 一 短 的 RNA 分 子 。（ 2） 延 伸 ：（ 3） 终 止4.DNA 的 损 伤 分 为
21、 ：点 突 变 ： 指 DNA 上 单 一 碱 基 的 变 异 。 嘌 呤 替 代 嘌 呤 （ A 与 G 之 间 的 相 互 替 代 ） 、 嘧 啶 替 代 嘧 啶 （ C 与 T 之 间 的 替代 ） 称 为 转 换 （ transition） ； 嘌 呤 变 嘧 啶 或 嘧 啶 变 嘌 呤 则 称 为 颠 换 （ transvertion） 。 缺 失 ： 指 DNA 链 上 一 个 或 一 段 核 苷 酸 的 消 失 。 插 入 ： 指 一 个 或 一 段 核 苷 酸 插 入 到 DNA 链 中 。 在 为 蛋 白 质 编 码 的 序 列 中 如 缺 失 及 插 入 的 核 苷 酸 数
22、 不 是 3 的 整 倍 数 ，则 发 生 读 框 移 动 （ reading frame shift） ， 使 其 后 所 译 读 的 氨 基 酸 序 列 全 部 混 乱 ， 称 为 移 码 突 变 （ frame-shift mutaion） 。 倒 位 或 转 位 ： 指 DNA 链 重 组 使 其 中 一 段 核 苷 酸 链 方 向 倒 置 、 或 从 一 处 迁 移 到 另 一 处 。双 链 断 裂 ： 已 如 前 述 ， 对 单 倍 体 细 胞 一 个 双 链 断 裂 就 是 致 死 性 事 件 。损 伤 的 原 因 ：（ 1） DNA 复 制 中 的 错 误 ，（ 2） DNA
23、的 自 发 性 化 学 变 化 ， 碱 基 的 异 构 互 变 碱 基 的 脱 氨 基 作 用 脱 嘌 呤 与 脱 嘧 啶 碱 基 修 饰 与 链 断 裂 （ 3） 紫 外 线 引 起 的 DNA 损 伤 ， TT 二 聚 体（ 4） 电 离 辐 射 引 起 的 DNA 损 伤 ， 碱 基 变 化 脱 氧 核 糖 变 化 DNA 链 断 裂 交 联 烷 化 剂 对 DNA 的 损 伤 ， 碱 基 烷 基 化 碱 基 脱 落 断 链 交 联（ 5） 碱 基 类 似 物 、 修 饰 剂 对 DNA 的 损 伤 ， 由 于 其 结 构 与 正 常 的 硷 基 相 似 ， 进 入 细 胞 能 替 代
24、正 常 的 硷 基 参 入 到DNA 链 中 而 干 扰 DNA 复 制 合 成 ， 例 如 5-BU 结 构 与 胸 腺 嘧 啶 十 分 相 近 ， 在 酮 式 结 构 时 与 A 配 对 ， 却 又 更 容 易 成 为烯 醇 式 结 构 与 G 配 对 ， 在 DNA 复 制 时 导 致 A-T 转 换 为 G-C。修 复 方 式 ：（ 1） 切 除 修 复 ： a 单 个 碱 基 切 除 。 b 核 苷 酸 片 段 切 除 修 复 。（ 2） 重 组 修 复 ： 重 组 修 复 从 DNA 分 子 的 半 保 留 复 制 开 始 ， 在 嘧 啶 二 聚 体 相 对 应 的 位 置 上 因
25、 复 制 不 能 正 常 进 行而 出 现 空 缺 ,在 大 肠 杆 菌 中 已 经 证 实 这 一 DNA 损 伤 诱 导 产 生 了 重 组 蛋 白 ,在 重 组 蛋 白 的 作 用 下 母 链 和 子 链 发生 重 组 ,重 组 后 原 来 母 链 中 的 缺 口 可 以 通 过 DNA 多 聚 酶 的 作 用 ,以 对 侧 子 链 为 模 板 合 成 单 链 DNA 片 断 来 填补 ,最 后 也 同 样 地 在 连 接 酶 的 作 用 下 以 磷 酸 二 脂 键 连 接 新 旧 链 而 完 成 修 复 过 程 。（ 3） SOS 修 复 ： 当 DNA 双 链 发 生 高 密 度 、
26、大片段损伤，原有的 DNA 活性也降低。此时，细胞紧急启动应急修复系统，诱导产生新的 DNA 聚合酶或修饰原有 DNA 聚合酶因子。（ 4） 直接修复：DNA 断裂口，二聚体，烷基化碱基5.原 核 生 物 基 因 表 达 的 调 控 主 要 为 （ 1）转录水平上的调控（2 ）转录后水平上的调控 mRNA 加工成熟水平上的调控翻译水平上的调控主 要 调 控 机 制 为 操 纵 子 ：（1）根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）的应答，可分为：正转录调控：在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控成为正转录调控。 负转录调控：在没有调节蛋白质存在时基
27、因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控称为负转录调控。（2）根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类：可诱导调节：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。例：大肠杆菌的乳糖操纵子诱导物：如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物 。 可阻遏调节：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。即在某些物质的阻遏下使基因关闭。例：色氨酸操纵子（3）在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白
28、（repressor ） ，起着阻止结构基因转录的作用。根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏：在负控诱导系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。负控阻遏（4）在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator） 。根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导和正控阻遏在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；在正控阻遏系统中，效应物分子（辅阻遏物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。6.真 核 生 物 基 因
29、表 达 调 控 的 环 节 ： 水 平 的 调 控 ， 转 录 水 平 的 调 控 ， 转 录 后 水 平 的 调 控 ， 翻 译 水 平 的 调 控 ， 翻 译 后 水 平 的调 控 （ 见 P62 和 第 八 章 ）7.翻 译 后 蛋 白 质 需 要 进 行 不 同 形 式 的 共 价 修 饰 ， 包 括 肽 链 N 端 甲 硫 氨 酸 残 基 的 切 除 ， 蛋 白 质 前 体 的 酶 切 修 饰 ， 氨 基酸 残 基 侧 链 基 团 的 磷 酸 化 去 磷 酸 化 、 乙 酰 化 去 乙 酰 化 等 。 翻 译 后 蛋 白 质 与 糖 链 共 价 结 合 成 糖 蛋 白 ， 称 糖 基
30、 化 修 饰 ，包 括 N-糖 基 化 和 O-糖 基 化 。 膜 蛋 白 经 过 豆 蔻 酰 化 和 棕 榈 酰 化 等 脂 酰 化 修 饰 才 能 定 位 于 膜 。 有 的 蛋 白 质 翻 译 后 由 两 个半 胱 氨 酸 残 基 上 的 巯 基 氧 化 形 成 二 硫 键 ， 使 蛋 白 质 的 立 体 结 构 更 稳 定 。 也 有 蛋 白 质 需 要 与 金 属 离 子 结 合 转 变 为 功 能 蛋白 质 。分 子 伴 侣 ： 一组从细菌到人广泛存在的蛋白质，非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合，并帮助它们折叠和转运，通常不参与靶蛋白的生理功能。主要有三大类：伴侣蛋白、热激
31、蛋白 70 家族和热激蛋白 90 家族。信号肽：分泌蛋白新生肽链 N 端的一段 2030 氨基酸残基组成的肽段。将分泌蛋白引导进入内质网，同时这个肽段被切除。现这一概念已扩大到决定新生肽链在细胞中的定位或决定某些氨基酸残基修饰的一些肽段。8.很复杂9.细 胞 周 期 蛋 白 ： 与 真 核 细 胞 的 细 胞 周 期 呈 模 同 步 周 期 性 浓 度 升 降 的 蛋 白 质 ， 相 对 分 子 质 量 50000 蛋 白 质 的 一 大 家族 ， 包 括 ： 周 期 蛋 白 质 A、 B、 D、 E、 G 及 H。 它 们 关 键 的 蛋 白 质 激 酶 （ 细 胞 周 期 蛋 白 依 赖
32、性 激 酶 ， cyclin-dependent kinases,CDKs） 结 合 ， 并 调 节 它 们 的 酶 活 性 ， 从 而 帮 助 推 动 和 协 调 细 胞 周 期 的 进 行 。10.基 因 克 隆 的 基 本 步 骤 ：一 目 的 DNA 片 段 的 获 得DNA 克 隆 的 第 一 步 是 获 得 包 含 目 的 基 因 在 内 的 一 群 DNA 分 子 ， 这 些 DNA 分 子 或 来 自 于 目 的 生 物 基 因 组 DNA或 来 自 目 的 细 胞 mRNA 逆 转 录 合 成 的 双 链 cDNA 分 子 。 由 于 基 因 组 DNA 较 大 ， 不 利
33、于 克 隆 ， 因 此 有 必 要 将 其 处 理成 适 合 克 隆 的 DNA 小 片 段 ， 常 用 的 方 法 有 机 械 切 割 和 核 酸 限 制 性 内 切 酶 消 化 。 若 是 基 因 序 列 已 知 而 且 比 较 小 就 可 用人 工 化 学 直 接 合 成 。 如 果 基 因 的 两 端 部 分 序 列 已 知 ， 根 据 已 知 序 列 设 计 引 物 ， 从 基 因 组 DNA 或 cDNA 中 通 过PCR 技 术 可 以 获 得 目 的 基 因 。 二 载 体 的 选 择基 因 工 程 的 载 体 应 具 有 一 些 基 本 的 性 质 ： 1） 在 宿 主 细
34、胞 中 有 独 立 的 复 制 和 表 达 的 能 力 ， 这 样 才 能 使 外 源 重 组 的DNA 片 段 得 以 扩 增 。 2） 分 子 量 尽 可 能 小 ， 以 利 于 在 宿 主 细 胞 中 有 较 多 的 拷 贝 ， 便 于 结 合 更 大 的 外 源 DNA 片 段 。同 时 在 实 验 操 作 中 也 不 易 被 机 械 剪 切 而 破 坏 。 3） 载 体 分 子 中 最 好 具 有 两 个 以 上 的 容 易 检 测 的 遗 传 标 记 （ 如 抗 药 性 标 记 基 因 ） ， 以 赋 予 宿 主 细 胞 的 不 同 表 型 特征 （ 如 对 抗 生 素 的 抗 性
35、 ） 。 4） 载 体 本 身 最 好 具 有 尽 可 能 多 的 限 制 酶 单 一 切 点 ， 为 避 开 外 源 DNA 片 段 中 限 制 酶 位 点的 干 扰 提 供 更 大 的 选 择 范 围 。 若 载 体 上 的 单 一 酶 切 位 点 是 位 于 检 测 表 型 的 标 记 基 因 之 内 可 造 成 插 入 失 活 效 应 ， 则 更 有利 于 重 组 子 的 筛 选 。 三 体 外 重 组体 外 重 组 即 体 外 将 目 的 片 断 和 载 体 分 子 连 接 的 过 程 。 大 多 数 核 酸 限 制 性 内 切 酶 能 够 切 割 DNA 分 子 形 成 有 粘 性
36、末 端 ， 用 同 一 种 酶 或 同 尾 酶 切 割 适 当 载 体 的 多 克 隆 位 点 便 可 获 得 相 同 的 粘 性 末 端 ， 粘 性 末 端 彼 此 退 火 ， 通 过 T4 DNA 连 接 酶 的 作 用 便 可 形 成 重 组 体 ， 此 为 粘 末 端 连 接 。 当 目 的 DNA 片 断 为 平 端 ， 可 以 直 接 与 带 有 平 端 载 体 相 连 ，此 为 平 末 端 连 接 ， 但 连 接 效 率 比 粘 端 相 连 差 些 。 有 时 为 了 不 同 的 克 隆 目 的 ， 如 将 平 端 DNA 分 子 插 入 到 带 有 粘 末 端的 表 达 载 体
37、 实 现 表 达 时 ， 则 要 将 平 端 DNA 分 子 通 过 一 些 修 饰 ， 如 同 聚 物 加 尾 ， 加 衔 接 物 或 人 工 接 头 ， PCR 法 引 入酶 切 位 点 等 ， 可 以 获 得 相 应 的 粘 末 端 ， 然 后 进 行 连 接 ， 此 为 修 饰 粘 末 端 连 接 。 各 种 连 接 策 略 间 的 关 系 总 结 如 下 ： 四 导 入 受 体 细 胞载 体 DNA 分 子 上 具 有 能 被 原 核 宿 主 细 胞 识 别 的 复 制 起 始 位 点 ， 因 此 可 以 在 原 核 细 胞 如 大 肠 杆 菌 中 复 制 ， 重 组 载 体中 的
38、目 的 基 因 随 同 载 体 一 起 被 扩 增 ， 最 终 获 得 大 量 同 一 的 重 组 DNA 分 子 。 将 外 源 重 组 DNA 分 子 导 入 原 核 宿 主 细 胞 的 方 法 有 转 化 （ transformation） ， 转 染 （ transfection） ， 转 导（ transduction） 。 重 组 质 粒 通 过 转 化 技 术 可 以 导 入 到 宿 主 细 胞 中 ， 同 样 重 组 噬 菌 体 DNA 可 以 通 过 转 染 技 术 导 入 。转 染 效 率 不 高 ， 因 此 将 重 组 噬 菌 体 DNA 或 柯 斯 质 粒 体 外 包
39、装 成 有 浸 染 性 的 噬 菌 体 颗 粒 ， 借 助 这 些 噬 菌 体 颗 粒 将 重 组DNA 分 子 导 入 到 宿 主 细 胞 转 导 技 术 ， 这 种 转 导 技 术 的 导 入 效 率 要 比 转 染 的 导 入 效 率 高 。 五 重 组 子 的 筛 选从 不 同 的 重 组 DNA 分 子 获 得 的 转 化 子 中 鉴 定 出 含 有 目 的 基 因 的 转 化 子 即 阳 性 克 隆 的 过 程 就 是 筛 选 。 目 前 发 展 起来 的 成 熟 筛 选 方 法 如 下 ： （ 一 ） 插 入 失 活 法 （ 二 ） PCR 筛 选 和 限 制 酶 酶 切 法 （
40、 三 ） 核 酸 分 子 杂 交 法 （ 四 ） 免 疫 学 筛 选 法 上 述 方 法 获 得 的 阳 性 克 隆 最 后 要 进 行 测 序 分 析 ， 以 最 终 确 认 目 的 基 因 。常 用 载 体 ： DNA 克 隆 常 用 的 载 体 有 ： 质 粒 载 体 （ plasmid） ， 噬 菌 体 载 体 （ phage） ， 柯 斯 质 粒 载 体（ cosimid） ， 单 链 DNA 噬 菌 体 载 体 （ ssDNA phage ） ， 噬 粒 载 体 （ phagemid） 及 酵 母 人 工 染 色 体 （ YAC） 等 。从 总 体 上 讲 ， 根 据 载 体 的
41、使 用 目 的 ， 载 体 可 以 分 为 克 隆 载 体 ， 表 达 载 体 ， 测 序 载 体 ， 穿 梭 载 体 等 。常 用 工 具 酶 ： 限 制 性 内 切 酶 DNA 分 子 的 特 异 切 割 。DNA 甲 基 化 酶 DNA 分 子 的 甲 基 化 。核 酸 酶 DNA 和 RNA 的 非 特 异 切 割 。核 酸 聚 合 酶 DNA 和 RNA 的 合 成 。核 酸 连 接 酶 DNA 和 RNA 的 的 链 接 。核 酸 末 端 修 饰 酶 DNA 和 RNA 的 末 端 修 饰 。其 它 破 壁 ， 转 化 ， 检 测 用 酶 。11.第十一章12. 第十二章转 基 因
42、 ： 运 用 科 学 手 段 从 某 种 生 物 中 提 取 所 需 要 的 基 因 ， 将 其 转 入 另 一 种 生 物 中 ， 使 与 另 一 种 生 物 的 基 因 进 行 重 组 ，从 而 产 生 特 定 遗 传 性 状 的 物 质 或 生 物 性 能 。基 因 敲 除 ： 将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。常用同源重组的方法。敲除的基因用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。反 义 RN
43、A： 与靶核酸 (如 mRNA 或有义 DNA)链互补的 RNA 分子，可抑制靶核酸的功能。RNAi 即 RNA 干 涉 ： 是 近 年 来 发 现 的 在 生 物 体 内 普 遍 存 在 的 一 种 古 老 的 生 物 学 现 象 ,是 由 双 链 RNA 介 导 的 、 由 特定 酶 参 与 的 特 异 性 基 因 沉 默 现 象 ,它 在 转 录 水 平 、 转 录 后 水 平 和 翻 译 水 平 上 阻 断 基 因 的 表 达13.化 学 转 染 法包 括 ： 1.DEAE-葡 聚 糖 法 ， 2.磷 酸 钙 法 ， 3.人 工 脂 质 体 法 。DEAE 葡 聚 是 最 早 应 用
44、哺 乳 动 物 细 胞 转 染 试 剂 之 一 ， DEAE-葡 聚 糖 是 阳 离 子 多 聚 物 ， 它 与 带 负 电 的 核 酸 结 合后 接 近 细 胞 膜 而 被 摄 取 ， 用 DEAE-葡 聚 糖 转 染 成 功 地 用 用 于 瞬 时 表 达 的 研 究 ， 但 用 于 稳 定 转 染 却 不 是 十 分 可 靠 。 磷酸 钙 法 是 磷 酸 钙 共 沉 淀 转 染 法 ， 因 为 试 剂 易 取 得 ， 价 格 便 宜 而 被 广 泛 用 于 瞬 时 转 染 和 稳 定 转 染 的 研 究 ， 先 将 DNA和 氯 化 钙 混 合 ， 然 后 加 入 到 PBS 中 慢 慢
45、 形 成 DNA 磷 酸 钙 沉 淀 ， 最 后 把 含 有 沉 淀 的 混 悬 液 加 到 培 养 的 细 胞 上 ， 通 过细 胞 胞 膜 的 内 吞 作 用 摄 入 DNA。磷 酸 钙 似 乎 还 通 过 抑 制 血 清 中 和 细 胞 内 的 核 酸 酶 活 性 而 保 护 外 源 DNA 免 受 降 解 .人 工 脂 质 体 法 采 用 阳 离 子 脂质 体 ， 具 有 较 高 的 转 染 效 率 ， 不 但 可 以 转 染 其 他 化 学 方 法 不 易 转 染 的 细 胞 系 ， 而 且 还 能 转 染 从 寡 核 苷 酸 到 人 工 酵 母 染色 体 不 同 长 度 的 DNA
46、， 以 及 RNA,和 蛋 白 质 .脂 质 体 体 外 转 染 同 时 适 用 于 瞬 时 表 达 和 稳 定 表 达 ， 与 以 往 不 同 的 是 脂 质 体 还 可 以 介 导 DNA 和 RNA 转 入 动 物和 人 的 体 内 用 于 基 因 治 疗 。 人 工 合 成 的 阳 离 子 脂 质 体 和 带 负 电 荷 的 核 酸 结 合 后 形 成 复 合 物 ， 当 复 合 物 接 近 细 胞 膜 时 被内 吞 成 为 内 体 进 入 细 胞 质 ， 随 后 DNA 复 合 物 被 释 放 进 入 细 胞 核 内 ， 至 于 DNA 是 如 何 穿 过 核 膜 的 ， 其 机 理
47、 目 前 还 不十 分 清 楚 . 物 理 转 染 法包 括 ： 显 微 注 射 电 穿 孔 基 因 枪 等 ，显 微 注 射 虽 然 费 力 ， 但 是 非 常 有 效 的 将 核 酸 导 入 细 胞 或 细 胞 核 的 方 法 。 这 种 方 法 常 用 来 制 备 转 基 因 动 物 ， 但却 不 适 用 于 需 要 大 量 转 染 细 胞 的 研 究 。电 穿 孔 法 常 用 来 转 染 如 植 物 原 生 质 体 这 样 的 常 规 方 法 不 容 易 转 染 的 细 胞 。 电 穿 孔 靠 脉 冲 电 流 在 细 胞 膜 上 打 孔 而 将核 酸 导 入 细 胞 内 。 导 入 的
48、 效 率 与 脉 冲 的 强 度 和 持 续 时 间 有 关 系 。基 因 枪 依 靠 携 带 了 核 酸 的 高 速 粒 子 而 将 核 酸 导 入 细 胞 内 ， 这 种 方 法 适 用 于 培 养 的 细 胞 核 在 体 的 细 胞 。14.PCR原 理类 似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程 ， 其 特 异 性 依 赖 于 与 靶 序 列 两 端 互 补 的 寡 核 苷 酸 引 物 。 PCR 由 变 性 -退 火 -延 伸三 个 基 本 反 应 步 骤 构 成 ： 模 板 DNA 的 变 性 ： 模 板 DNA 经 加 热 至 93 左 右 一 定 时 间 后 ， 使 模 板
49、DNA 双 链 或 经PCR 扩 增 形 成 的 双 链 DNA 解 离 ， 使 之 成 为 单 链 ， 以 便 它 与 引 物 结 合 ， 为 下 轮 反 应 作 准 备 ； 模 板 DNA 与 引 物 的退 火 (复 性 )： 模 板 DNA 经 加 热 变 性 成 单 链 后 ， 温 度 降 至 55 左 右 ， 引 物 与 模 板 DNA 单 链 的 互 补 序 列 配 对 结 合 ； 引 物 的 延 伸 ： DNA 模 板 -引 物 结 合 物 在 TaqDNA 聚 合 酶 的 作 用 下 ， 以 dNTP 为 反 应 原 料 ， 靶 序 列 为 模 板 ， 按 碱 基配 对 与 半 保 留 复 制 原 理 ， 合 成 一 条 新 的 与 模 板 DNA 链 互 补 的 半 保 留 复 制 链 重 复 循 环 变 性 -退 火 -延 伸 三 过 程 ， 就 可获 得 更 多 的 “半 保 留 复 制 链 ”， 而 且 这 种 新 链 又 可 成 为 下 次 循 环 的 模 板 。 每 完 成 一 个 循 环 需 2 4 分 钟 ， 2 3 小 时 就能 将 待 扩 目 的 基 因 扩 增 放 大 几 百 万 倍 。
